יצירת מודל תרבית איברים להדמיית מחלת דיסק בין-חולייתי בשלב מוקדם

תקציר

מקור: Saravi, B. et al., מודל תרבית איברים פרו-דלקתי, ניווני להדמיית מחלת דיסק בין-חולייתי בשלב מוקדם. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מדגים את הפיתוח של מודל תרבית איברים פרו-דלקתית וניוונית למחלת דיסק בין-חולייתי בשלב מוקדם (IVD) באמצעות TNF-α. הוא מתאר את הליך הזרקת TNF-α לדיסק הבין חולייתי ומסביר את המנגנונים שדרכם TNF-α גורם לדלקת והשפלה של ה- IVD.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המתאימה לבעלי חיים.

1. תרבית וטעינה של דיסק בין-חולייתי (IVD)

1. העבירו את הדיסקים הבין חולייתיים (IVD) לתאי IVD והוסיפו מדיום תרבית IVD (מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM, 4.5 גרם/ליטר DMEM גבוה של גלוקוז לקבוצה הפיזיולוגית ו-2 גרם/ליטר DMEM נמוך של גלוקוז לקבוצה הפתולוגית) + 1% פניצילין/סטרפטומיצין + 2% סרום עגל עוברי + 1% ITS (מכיל 5 מיקרוגרם/מ"ל אינסולין, 6 מיקרוגרם/מ"ל טרנספרין, ו-5 ננוגרם/מ"ל חומצה סלנית) + 50 מיקרוגרם/מ"ל אסקורבט-2-פוספט + 1% חומצת אמינו לא חיונית + 50 מיקרוגרם/מ"ל חומר אנטי-מיקרוביאלי לתאים ראשוניים) ולהניח באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס, 85% לחות ו-5% CO₂.
2. תרבית הדיסקים למשך 4 ימים בתוך מערכת ביו-ריאקטור לפי קבוצות ניסוי. בקבוצה הפתולוגית, שמור על תנאי טעינה ניווניים ב 0.32-0.5 מגה פיקסל, 5 הרץ למשך שעתיים ביום. בקבוצת הבקרה הפיזיולוגית, השתמש בפרוטוקול טעינה של 0.02-0.2 מגה פיקסל, 0.2 הרץ למשך שעתיים ביום.
   הערה: מקם את ה-IVD בתאים המכילים 5 מ"ל של מדיום IVD במהלך הליכי ההעמסה. הנפח תלוי בגודל תאי הטעינה של הביוריאקטור. בין הליכי ההעמסה, הנח את ה-IVD בצלחות של שש בארות עם 7 מ"ל של מדיום תרבית IVD להתאוששות מנפיחות חופשית.
3. לניתוח השינויים בגובה הדיסק במהלך תקופת הניסוי, מדוד את גובה הדיסק עם קליפר לאחר דיסקציה IVD (קו בסיס) ולאחר מכן מדי יום לאחר תקופת הנפיחות החופשית ולאחר טעינה דינמית למשך הניסוי.

2. הזרקת גורם נמק גידול תוך דיסקלי-אלפא (TNF-α)

1. מיד לאחר מחזור ההעמסה הדינמי הראשון ביום הראשון, הנח את ה-IVD בצלחת פטרי במצב אנכי וייצב את ה-IVD עם פינצטה.
2. הזרקת TNF-α רקומביננטי (100 ננוגרם ב-70 מיקרוליטר של מי מלח חוצץ פוספט (PBS) לכל IVD) עם מחט אינסולין בגודל 30 לרקמת הגרעין של הקבוצה הפתולוגית. הזרקה איטית במהירות של כ-70 מיקרוליטר בדקה אחת.
3. לאחר ההזרקה, משוך את המזרק באמצע הדרך לאחור בתוך ה- IVD ומשוך את בוכנת המזרק כדי ליצור ואקום המונע מהתמיסה המוזרקת לדלוף בחזרה לפני הסרת המחט והמזרק לחלוטין מה- IVD.
   הערה: בצע ניסוי פיילוט על ידי הזרקת PBS המכיל צבע כחול טריפן כדי להעריך את התפלגות התמיסה המוזרקת לאחר טעינה ותרבית לילה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אסקורבט-2-פוספט	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, ארה"ב	A8960
TNF-אלפא, חלבון אנושי רקומביננטי	מערכות מו"פ, מינסוטה, ארה"ב	210-TA-005
בקר IL-8 עשה זאת בעצמך ELISA	קינגפישר ביוטק, סנט פול, ארה"ב	DIY1028B-003
קורנינג ITS Premix	קורנינג בע"מ, ניו יורק, ארה"ב	354350
גלוקוז גבוה ב-DMEM	Gibco by life technologies, קרלסבד, ארה"ב	10741574
DMEM גלוקוז נמוך	Gibco by life technologies, Carlsbad, USA	11564446
אתנול לביולוגיה מולקולרית	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, ארה"ב	09-0851
סרום בקר עוברי (FBS)	Gibco by life technologies, קרלסבד, ארה"ב	A4766801
תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות	Gibco by life technologies, קרלסבד, ארה"ב	11140050
פניצילין/סטרפטומיצין(P/S)	gibco by Life Technologies, קרלסבד, ארה"ב	11548876
תמיסת חיץ פוספט, טבליות	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, ארה"ב	P4417
פרימוצין	InvivoGen, Sandiego, USA	ant-pm-05