השגת תרחיף של תא בודד מרקמת מוח של חולדה קפואה

תקציר

מקור: Rubio, F. J., et. al. מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) וניתוח ביטוי גנים של נוירונים המבטאים פוס מרקמת מוח של חולדה טרייה וקפואה. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים את הדיסוציאציה של רקמת מוח קפואה של חולדה לתרחיף חד-תאי באמצעות עיכול אנזימטי וטריטורציה מכנית. התאים המוכנים מקובעים וחדירים באתנול ליישומים במורד הזרם כמו ציטומטריית זרימה או ניתוח ביטוי גנים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים והסקירה הווטרינרית של JoVE.

1. הכנה לפני איסוף רקמות

1. הגדר את הצנטריפוגה ל-4 ^oC.
2. מלטש אש סט של שלוש פיפטות פסטר מזכוכית בקוטר יורד של כ-1.3, 0.8 ו-0.4 מ"מ לכל דגימה.
3. הכן צינורות 1.7 מ"ל מסומנים המכילים 1 מ"ל Buffer A קר והשאירו את הצינורות על קרח.
4. הכינו מגש קרח המכיל את מטריצת החיתוך של המוח, מרית וצלחות זכוכית (או צלחת פטרי מזכוכית הפוכה) שעליהן ניתן לבצע את הדיסקציה. יש לקרר מראש שני סכיני גילוח או יותר על לוחות הזכוכית ולהשתמש בנייר טישו כדי לייבש את כל המכשירים הנוגעים ברקמה.
5. יש להפשיר את תמיסת האנזים בטמפרטורת החדר (RT) למשך 30 דקות לפני איסוף הרקמות.

2. איסוף וחיתוך רקמות

1. התחל את הטיפול ההתנהגותי או התרופתי 90 דקות לפני איסוף הרקמות.
   הערה: עבור התוצאות המוצגות כאן, בוצעו הזרקות תוך-צפקיות חריפות של 5 מ"ג/ק"ג מתאמפטמין על חולדות בסביבה חדשה (תנאי בדיקה) וחולדות נאיביות שהוחזקו בכלובי הבית שלהן (מצב ביקורת).
2. להרדים את החולדה על ידי הנחתה בצנצנת ייבוש זכוכית עם איזופלורן רווי ולערוף את ראשה של החולדה 30 - 60 שניות לאחר מכן באמצעות גיליוטינה.
   השתמש במספריים כדי להסיר את העור והשריר מהראש ולחשוף את הגולגולת. השתמש ב-rongeurs כדי לחתוך את הגולגולת, לפתוח את הנקב מגנום ולהסיר את החלק האחורי של הגולגולת. השתמש ב-rongeurs כדי לחתוך לאורך הקצוות העליונים של הגולגולת כדי לחשוף את המוח. היזהר לא לפגוע במוח. השתמשו במרית קטנה כדי לגרוף בעדינות מתחת למוח ולהגביה אותו. הרימו את המוח וחתכו את העצבים עד שהמוח יהיה חופשי.
3. נתח רקמות באמצעות סכיני גילוח.
   הערה: להשיג דגימות רקמה באחת מהשיטות הבאות: (2.3.1) רקמה שזה עתה נותחה; (2.3.2) רקמה קפואה לאחר נתיחה; או (2.3.3) רקמה קפואה שנותחה ממוח שלם קפוא. שמור על מטריצת החיתוך של המוח, סכיני הגילוח וצלחת הזכוכית יבשים לאורך כל תהליכי החיתוך והטחינה, שכן מים מרוכזים עלולים להוביל לליזה היפוטונית של תאים. השתמש במשקפי מגדלת כדי להבטיח חיתוך מדויק.
   1. עבור רקמה שזה עתה נותחה, הנח את המוח שזה עתה חולץ לתוך מטריצה לחיתוך מוח (תבנית מתכת בצורת מוח של חולדה עם חריצים לסכיני הגילוח במרווחים של 1 מ"מ) שצוננה על קרח. הכנס שני סכיני גילוח או יותר מקוררים מראש לתוך החריצים כדי לחתוך פרוסות עטרה המכילות את האזור או האזורים במוח המעניינים. מניחים את הפרוסה החתוכה על צלחת הזכוכית המצוננת.
      הערה: נתחו את אזורי העניין במוח על צלחת זכוכית מקוררת.
   2. עבור רקמה קפואה לאחר דיסקציה, נתחו את האזורים המעניינים במוח מפרוסות מוח שזה עתה חולצו, בדומה לזה שתואר לעיל ב-2.3.1. הנח את הרקמה המנותחת לתוך מיקרו-צינור והקפיא במהירות את הרקמה על ידי טבילת המיקרו-צינור באיזופנטן -40 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות. שמור רקמות מנותחות קפואות בכל עת במקפיא של -80 מעלות צלזיוס עד לעיבוד נוסף.
   3. לרקמות קפואות, יש להקפיא מיד את המוח הטרי שחולץ באיזופנטן של -40 מעלות צלזיוס ולאחסן בשקית אטומה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
      1. ביום הדיסקציה, הנח את המוח הקפוא בקריוסטט המוגדר על כ-20 מעלות צלזיוס (לא חם יותר מ-18 מעלות צלזיוס) למשך כשעתיים כדי לאזן את הטמפרטורה.
         הערה: מוחות יכולים להיחתך בקלות בטמפרטורה זו, בעוד שטמפרטורות נמוכות בהרבה הופכות את המוח לשביר מכדי שניתן יהיה לחתוך אותו בבטחה.
      2. השתמש בסכיני גילוח כדי לחתוך פרוסות עטרה של 1 - 2 מ"מ של המוח הקפוא בקריוסטט. בתנאי הקפאה, השתמש במחט קהה בגודל 12 עד 16 כדי להשיג אגרופי רקמות מהפרוסות הללו. שמור רקמות מנותחות קפואות בכל עת עד לעיבוד נוסף.
   4. יש להוסיף 1-2 טיפות של Buffer A כדי לכסות את הרקמה המנותחת לפני הטחינה. הסר את רוב החומר הלבן מהרקמה באמצעות שני סכיני גילוח כדי למנוע אובדן של תאי עצב במהלך שאר תהליך הטריטורציה. אם מתחילים עם רקמה קפואה, יש לאפשר לרקמה להפשיר על צלחת הזכוכית הקרה לא יותר מדקה אחת לפני מריחת תמיסת Buffer A.
   5. טוחנים את הרקמה 100 פעמים בכל כיוון אורתוגונלי בעזרת סכין גילוח על צלחת זכוכית צוננת. החזק את סכין הגילוח אנכית לצלחת הזכוכית בעת הטחינה.
      הערה: טחינה יסודית היא קריטית לכל שלבי הפרוטוקול.
   6. השתמש בסכיני גילוח כדי להעביר את הרקמה הטחונה לצינורות מיקרו-צנטריפוגה המכילים 1 מ"ל של מאגר קר A. הפוך את הצינור 3 - 5 פעמים כדי לשמור על כל הרקמה הטחונה בתמיסה.

3. דיסוציאציה של תאים

הערה: השתמש בערבוב עדין מקצה לקצה עבור כל השלבים הבאים. אל תשתמש במיקסר מערבולת והימנע מבועות אוויר הגורמות לנזק לתאים.

1. צנטריפוגה את צינורות הדגימה ב-110 x גרם למשך 2 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. הוסיפו באיטיות 1 מ"ל של תמיסת אנזים קרה ומופשרת (המכילה תערובת של אנזימים פרוטאוליטיים) במורד הדופן הפנימית של המיקרו-צינורית. מוצצים מיד את כל הגלולה ומעבירים בעדינות למעלה ולמטה רק 4 פעמים עם פיפטה בקוטר קצה גדול למדי כדי לפזר את כדור הרקמה הטחון.
2. הפוך את המיקרו-צינורות מיד כדי למנוע מהגלולה להידבק לתחתית, ודגר את הדגימות עם ערבוב מקצה לקצה למשך 30 דקות ב-4 ^oC.
3. לאחר עיכול רקמות אנזימטיות, צנטריפוגה את הצינורות ב-960 x g למשך 2 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנט והוסף 0.6 מ"ל של מאגר קר A. מיד לאחר הוספת מאגר A, השתמש באותו קצה פיפטה כדי לפזר את הגלולה על ידי יניקת הגלולה כולה ופיפטה בעדינות למעלה ולמטה 5 פעמים.
4. יש לשלש מכנית את הרקמה המעוכלת ולאסוף בצינורות של 15 מ"ל באמצעות השלבים הבאים. עבור כל דגימה, השתמש בסט נפרד של 3 פיפטות פסטר מזכוכית מלוטשת באש בקטרים יורדים של כ-1.3, 0.8 ו-0.4 מ"מ המחוברות לנורות לטקס.
   1. שלשו בעדינות כל דגימה 10 פעמים עם פיפטת הזכוכית בגודל 1.3 מ"מ. הניחו לדגימה להתיישב במשך 2 דקות על קרח (הפסולת והתאים הלא מנותקים ישקעו לתחתית). אספו את הסופרנטנט (~0.6 מ"ל) והעבירו אותו לשפופרת חרוטית של 15 מ"ל (שפופרת #1).
   2. הוסף 0.6 מ"ל תמיסת Buffer A לגלולה הנותרת. שלש את הדגימה 10 פעמים עם פיפטת הזכוכית 0.8 מ"מ. תן לדגימה להתיישב במשך 2 דקות על קרח. יש לאסוף את הסופרנטנט (~0.6 מ"ל) ולהעביר אותו לאותה שפופרת חרוטית של 15 מ"ל #1.
   3. הוסף 0.6 מ"ל תמיסת Buffer A לגלולה הנותרת. טרש את הדגימה 10 פעמים עם פיפטת הזכוכית 0.4 מ"מ. תן לדגימה להתיישב במשך 2 דקות על קרח. אספו את הסופרנטנט (~0.6 מ"ל; מבלי לגעת בכדור עם תאים לא מנותקים) והעבירו לאותו צינור חרוטי של 15 מ"ל #1.
      הערה: שמור את הפיפטה בקוטר 0.4 מ"מ בצינור #1 לשלבי הטריטורציה הבאים.
   4. חזור על שלב 3.4.3 שלוש פעמים נוספות באמצעות פיפטת הזכוכית הקטנה ביותר (קוטר ~0.4 מ"מ), ואסוף את הסופרנטנט לתוך צינור חרוטי נפרד של 15 מ"ל (צינור #2).
   5. שלש את תרחיפי התאים שנאספו בצינורות #1 ו-#2 במשך 10 פעמים נוספות באמצעות פיפטת הזכוכית 0.4 מ"מ ושמור אותם על קרח.

4. קיבוע תאים וחדירות תאים

1. הכינו 4 מיקרו-צינורות לכל דגימה (שני מיקרו-צינוריות לתאים משפופרת #1 ושניים לתאים משפופרת #2) על ידי הוספת 800 מיקרוליטר של 100% אתנול קר (מאוחסן ב-20 ^oC לפני השימוש) לכל שפופרת ושמרו אותם על קרח. הערה: ריכוז האתנול הסופי יהיה 50%.
2. פיפטה ~ 800 מיקרוליטר של תרחיפי התאים (מצינור #1 וצינור #2) לכל אחד מ-4 הצינורות המכילים אתנול קר והופכים את הצינורות כדי לערבב את הדגימות.
3. דגרו צינורות על קרח למשך 15 דקות תוך היפוך הצינורות כל 5 דקות.
4. לאחר קיבוע/חדירה, צנטריפוגה את הצינורות ב-1,700 x גרם למשך 4 דקות ב-4 מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט. השאירו 50 מיקרוליטר תמיסה כדי למנוע אובדן תאים.
   הערה: הכדורים בשלב זה לבנים ונדבקים פחות לדופן הצינורות מאשר לפני החדירה. לכן, הסירו את ה-supernatant בזהירות על ידי נגיעה בדופן של המיקרו-צינורית היכן שאין כדור, ומשכו את ה-supernatant לאט באמצעות מיקרו-פיפטה.

5. סינון תאים

1. השעו מחדש את הכדורים משלב 4.4 עם PBS קר באופן הבא:
   1. הוסף 550 מיקרוליטר של PBS קר לאחד משני המיקרו-צינורות המגיעים מצינור #1, והשתמש בקצה פיפטה בקוטר גדול למדי כדי להזיז בעדינות את מתלה התא למעלה ולמטה 5 פעמים. חזור על אותו הדבר עבור מיקרו-צינור אחד שמגיע מצינור #2.
   2. עבור תאים מצינור #1, באמצעות אותה פיפטה, העבירו את תרחיף התא הראשון לגלולה השנייה. השעו מחדש את הכדור השני על ידי פיפטינג עדין של מתלה התא המשולב למעלה ולמטה 5 פעמים.
   3. עבור תאים משפופרת #2, השעו מחדש ושלבו את הכדורים (כלומר, מיקרו-צינורות שלישי ורביעי) כמתואר ב-5.1.2.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מטריצת מוח	CellPoint Scientific	69-2160-1	כדי להשיג פרוסות מוח קורונליות
מצב שינה פלואורסצנטי נמוך	ביטים למוח	HA-lf	מאגר A' בפרוטוקול משמש לעיבוד רקמות ותאים משלבי הדיסוציאציה לשלבי הקיבוע
אקוטאז	מיליפופר	SCR005	תמיסת אנזים' בפרוטוקול משמשת לעיכול אנזימטי של רקמות לפני טריטורציה
מסננת תאים, 40 מיקרומטר	בז BD	352340	כדי לסנן השעיית תאים
מסננת תאים, 100 מיקרומטר	בז BD	352360	כדי לסנן השעיית תאים
פלקון 5 מ"ל מבחנה פוליסטירן עגול תחתון עם מכסה הצמד מסננת תאים	BD Bioscience	352235	לסנן תרחיף תאים לפני שעוברים דרך ציטומטר הזרימה
פסטר פיפט, זכוכית	אספקת NIH	6640-00-782-6008	כדי לבצע טריטורציה של רקמות