מאמר שיטה

הגדלת התשואות cDNA של תא בודד כמויות ה-mRNA בתקן Reverse transcriptase תגובות מעבדה באמצעות Microstreaming אקוסטית

DOI:

10.3791/3144

⸱

11 ביולי 2011

 ,  ,  ,  ,  , 
1Florey Neuroscience Institutes and Centre for Neuroscience, University of Melbourne, 2Fluid Dynamics Group, CSIRO Materials Science and Engineering, 3Swinburne University of Technology, Faculty of Engineering and Industrial Sciences

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים שיטה חדשה להגדלת התשואה cDNA של תא בודד של mRNA בכמויות ברמת אחרת הפוכה התגובות מעבדה שעתוק. החידוש מתגורר השימוש micromixer, אשר מנצל את התופעה של microstreaming אקוסטי, לערבב נוזלים בקני מידה microliter בצורה יעילה יותר מאשר רועד, vortexing או טחינה דקה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביטוי גנים correlating עם התנהגות התא נעשית באופן אידיאלי ברמת מתחיל מתא בודד. עם זאת, זו אינה מושגת בקלות כי כמות קטנה של mRNA יציב נוכח בתא בודד (1-5% של 1-RNA 50pg הכולל, או 0.01-mRNA 2.5pg, לכל תא 1) בעיקר מדרדרת לפני שניתן יהיה להפוך עיבד לתוך עותק cDNA יציב. לדוגמה, באמצעות ריאגנטים מעבדה סטנדרטיים החומרה, רק מספר קטן של גנים ניתן להעריך איכותית לכל תא 2. דרך אחת להגביר את היעילות של תקן מעבדה הפוכה transcriptase (RT) תגובות (ריאגנטים כלומר תקן בכמויות microliter) הכולל תא בודד כמויות של mRNA יהיה במהירות רבה יותר בתמהיל ריאגנטים כך את ה-mRNA ניתן להמיר cDNA לפני שהיא מדרדרת. אולם זה לא טריוויאלי כי בקני מידה microliter זרימת הנוזל היא למינרית, כלומר השיטות הקיימות כיום של ערבוב (כלומר רועד, vortexing ו טחינה דקה) לא מצליחים לייצר תנועה כאוטית מספיק ביעילות לערבב חומרים כימיים. כדי לפתור בעיה זו, מיקרו בקנה מידה טכניקות ערבוב צריך לשמש 3,4. מספר microfluidic טכנולוגיות מבוססות ערבוב אשר פותחו בהצלחה להגדיל את התשואות RT תגובה 5-8. עם זאת, טכנולוגיות מיקרופלואידיקה דורשים חומרה מיוחדת, כי הוא יקר יחסית, עדיין אינו זמין באופן נרחב. פתרון זול יותר, נוח יותר רצוי. המטרה העיקרית של מחקר זה היא להדגים כיצד היישום של טכניקה חדשנית "micromixing" לתגובות מעבדה סטנדרטיים RT הכוללת תא בודד כמויות של mRNA מגביר באופן משמעותי בתשואות cDNA שלהם. אנו מוצאים תשואות cDNA להגדיל בכ 1-10 כפולה, המאפשרת: (1) במספרים גדולים יותר של גנים כדי להיות מנותח לכל תא, (2) ניתוח כמותי יותר של ביטוי גנים; ו (3) זיהוי טוב יותר נמוכה שפע גנים בתוך תאים בודדים. Micromixing מבוססת על אקוסטית microstreaming 9-12, תופעה שבה גלי הקול מתפשט סביב מכשול קטן ליצור זרימה מתכוון ליד המכשול. פיתחנו מכשיר אקוסטי microstreaming מבוססות ("micromixer"), עם פישוט מפתח: microstreaming אקוסטי ניתן להשיג בתדרים אודיו ידי הבטחת למערכת יש ממשק נוזלי אוויר עם רדיוס עקמומיות קטן של 13. המניסקוס של נפח microliter של פתרון צינור מספק רדיוס קטן כראוי של עקמומיות. השימוש בתדרי שמע כלומר החומרה יכול להיות זולה צדדי 13, וחומצות גרעין ו ריאגנטים ביוכימיים אחרים אינם פגומים כמו שהם יכולים להיות עם sonicators מעבדה סטנדרטיים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Micromixing תגובה RT

  1. לפני ביצוע תגובה RT עם micromixing, לאזן micromixer לטמפרטורה הרצויה התגובה RT.
    1. מניחים את micromixer בתוך 37 ° C (או הטמפרטורה המומלצת על ידי הספק RT) חממה לפחות שעה 1 לפני תחילת התגובה RT.
  2. הגדרת תמהיל RT לפי הספק של transcriptase הפוכה (למשל MMTV-RT מ Promega, Omniscript מ Qiagen) הוראות, למעט תא בודד כמויות להשתמש בסך הכל קלט RNA (למשל 0.1-1pg/μl), במקום מיקרוגרם ng- כמויות המומלץ על ידי הספקים.
    1. אנו משתמשים תקן סטרילי, nuclease ללא 200μL דק דופן צינורות PCR.
  3. מיקום RT צינורות היטב לתוך micromixer ברגע שהם מוכנים ערבוב. Micromixer צריך להישאר בתוך 37 ° C החממה למשך התגובה RT.
  4. בחר את התדירות המתאימה משרעת של micromixing. בדוגמה זו אנו משתמשים 150Hz.
  5. כבה את micromixer על ולהשאיר אותה במשך כל תקופת התגובה RT (60 דקות).
  6. כבה את micromixer את לקחת את שפופרות RT החוצה פעם את התגובה RT תושלם.
  7. מניחים את צינורות RT על הקרח ולהמשיך כרגיל עם יישומים נוספים, כגון תגובת שרשרת כמותי פולימראז (qPCR או בזמן אמת PCR).

2. נציג תוצאות:

היתרון של micromixing בהקשר של תגובות RT היא עלייה בתשואה cDNA יחסית כאשר שיטות ערבוב אחרים (כגון טלטולים, vortexing או טחינה דקה) משמשים. ניתן לראות זאת, למשל, על ניתוח בדיעבד של התגובה cDNA באמצעות כמותי פולימראז שרשרת (qPCR או בזמן אמת PCR). איור 2A ממחיש את ההשפעות של micromixing במשך 5 הדקות הראשונות (כחול, "micromixed5") או כל 60 דקות (אדום, "micromixed60") לעומת טחינה דקה התגובה RT מיד לפני הדגירה RT (שחור, "טחינה דקה" ). במקרה זה את עוצמת התגובה RT הקודמת היה 25μL והוא הכיל 2.5pg של רנ"א מוחלט. עקבות qPCR באמצעות primers נועד לזהות Nurr-1 cDNA המייצג mRNA מוצגים לעיל, וכן אמצעי ± SEMs של מספר מחזורים כדי להגיע הקרינה המקסימלית של 50% 3 חזרות של הניסוי הזה הם זממו אותו למטה. הכוכבית מציינת הבדל משמעותי סטטיסטית (ANOVA חד כיווני עם השוואות טיוקי מרובים). שים לב micromixing במשך 5 הדקות הראשונות של התגובה הקודמת RT המיוצר שיפור לא משמעותי על פני טחינה דקה ואילו micromixing במשך 60 דקות שלמות של התגובה הקודמת RT המיוצר שיפור משמעותי לעומת טחינה דקה, גודל שהיה שווה ערך ל כ 15 qPCR מחזורי, בממוצע.

היתרון של micromixing ניתן גם לראות ניתוח עקומת התכה של המוצרים הבאים המתקבלים qPCR. במהלך הניסוי ממחישה 2B איור, micromixing במשך 60 דקות שלמות של התגובה RT הקודמת הביאו אות qPCR עקבית כפולות דגימות (איור 2BA, 2 עקבות אדום), ואילו micromixing במשך 5 הדקות הראשונות או טחינה דקה מיוצר רק qPCR עקבי עקבות (איור 2BA, 2 עקבות כחול 2 עקבות שחור, בהתאמה). עקבות אפור פיקוח שליליים ("נג"). CDNA שבו הושאר מחוץ התגובה qPCR. כאשר המוצרים qPCR מניסוי זה היו מפוגל ידי ramping הטמפרטורה שלהם (כלומר ניתוח עקומת התכה) היה ברור כי ראוי PCR המוצרים (כלומר amplicon היה זהה לזה שהושג כאשר ריכוזים גבוהים בהרבה של mRNA תועתקו הפוך מוגבר על ידי qPCR, מידע לא מוצג) נכחו רק התגובות הבאות RT שהיו micromixed במשך 60 דקות (איור 2Bb, 2 עקבות אדומים). כל האחרים (כלומר micromixed5, טחינה דקה בקרות שלילי) שנוצר amplicon מוצרים אלטרנטיביים (למשל הדימרים פריימר).

figure-protocol-1
באיור 1. תרשים זרימה של פרוטוקול ליישום micromixing לרמת התגובות מעבדה RT. תיאורים מפורטים יותר של עקרון פיזית המעורבים, micromixer וכיצד לבנות בתוך הבית micromixer ניתנים הפניות 13,14

figure-protocol-2
איור 2. נציג נתונים qPCR הממחישות את היתרונות של micromixing להחיל הקודמת התגובות RT הכוללת תא בודד כמויות של mRNA בתגובות מעבדה סטנדרטיים אחרת RT. דוגמה עקבות qPCR גילוי mRNA המייצג cDNA קידוד Nurr-1 הגן. התגובות הקודמות RT הכלול 2.5pg של רנ"א הכולל בהיקף של 25μL ו בוצעו באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. התגובות היו מעורבות RT ידי טחינה דקה של RT לערבב לפני הדגירה (עקבות שחורים, "טחינה דקה"), micromixed במהלך 5 הדקות הראשונות של התגובה RT (עקבות כחול, "micromixed5") או micromixed במשך 60 דקות שלמות של התגובה RT (עקבות אדומים, "micromixed60" ). אמצעי ± SEMs של מספר מחזורים qPCR נדרש להגיע הקרינה המקסימלית 50% הם זממו להלן עבור n = 3 חזרות של הניסוי הזה. כוכבית מציינת הבדל משמעותי (ANOVA חד כיווני עם השוואות טיוקי מרובים). B ניסוי נוסף qPCR בחינת Nurr-1 מוצר cDNA, הפעם בעקבות התגובות RT המכיל 25pg של רנ"א הכולל בהיקף של 25μL. עקבות qPCR (א), כמו גם ניתוח עקומת התכה של המוצרים qPCR שהושגו (ב) מוצגים על תנאי ערבוב שונים. שולטת שלילי שבו לא cDNA נכלל התגובה RT הקודמת כלולים גם (עקבות אפור, "נג").. התגובות RT עם ריכוזים גבוהים בהרבה של mRNA בוצעו גם והפיק עקומת התכה פסגות (מידע לא מוצג) זהים לאלה (ב) עבור micromixed60 (עקבות אדומים) דגימות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטת היישום של micromixing לרמת התגובות מעבדה RT המתואר כאן יכול, כמובן, כרוך mRNA שנקטפו באמצעות שיטה כלשהי (למשל תמוגה התא, לייזר microdissection ללכוד). זה גם יכול לכלול כל המותגים או סוגי RT ריאגנטים, כל טמפרטורה (תוך סובלנות של החומרים של micromixer), וכל תקופה. לדוגמה, ראינו שיפור התשואות cDNA מתגובות RT הכוללת hexamer אקראי או אוליגו DT-primers. זה יכול להיות מיושם גם על התמורות ביוכימיים אחרים (כגון דנ"א הכלאה 15) העומדות על האילוצים הבאים. האילוץ העיקרי של...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי הבריאות הלאומי המועצה למחקר רפואי של אוסטרליה (הפרויקט להעניק אין. 6288480) ואת סקובי וקלייר מקינון אמון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם מגיב חברה מספר קטלוגי הערות (אופציונלי)
סה"כ היה RNA שבודד קפוא הצמד פרוסות מוכן בחריפות עכבר מבוגר המוח התיכון
PicoPure RNA בידוד Kit ארקטורוס, קליפורניה, ארה"ב KIT0204 הערכה זמינה כעת מ-Applied Biosystems
ה-DNA בחינם DNase טיפול להסרת ריאגנטים Ambion AM1906M
אקראיים hexamer primers Promega C1181
AMV-RT Promega M5101
dNTP להגדיר Promega U1240
RNasin Ribonuclease אינהיביטור Promega N2111
Nuclease ללא מים Promega P1193
SYBR גרין PCR מאסטר מיקס אפלייד Biosystem 4309155
Hprt קדימה (20mer): CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT
Hprt הפוך (20mer): תאת GTC CCC CGT TGA CTG AT
Nurr1 קדימה (23mer): החטיבה CTC CGA TTT CTT AAC TCC AG
Nurr1 הפוך (23mer): GGT GAG GTC CAT GCT AAA CTT GA
NanoDrop 1000 ספקטרופוטומטר. Thermo Scientific
קורבט רוטור ג'ין RG-6000 קורבט מדעי החיים קורבט מדעי החיים נרכשה על ידי QIAGEN ביולי 2008

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Livesey, F. J. Brief Funct Genomic Proteomic. 2 (1), 31-31 (2003).
  2. Aumann, T. D., Gantois, I., Egan, K. Exp Neurol. 213 (2), 419-419 (2008).
  3. Ottino, J. M., Wiggins, S. Philos Transact A Math Phys Eng Sci. 362 (1818), 923-923 (2004).
  4. Losey, M. W., Jackman, R. J., Firebaugh, S. L. J Microelectromech. Syst. 11, 709-709 (2002).
  5. Bontoux, N., Dauphinot, L., Vitalis, T. Lab Chip. 8 (3), 443-443 (2008).
  6. Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. Anal Chem. 78 (9), 3084-3084 (2006).
  7. Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. Anal Chem. 78 (3), 956-956 (2006).
  8. Warren, L., Bryder, D., Weissman, I. L. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (47), 17807-17807 (2006).
  9. Jiao, Z. J., Huang, X. Y. Microfluidics Nanofluidics. 6, 847-847 (2009).
  10. Ahmed, D., Xiaole, M., Juluri, B. K. Microfluidics Nanofluidics. 7, 727-727 (2009).
  11. Paxton, W. F., O'Hara, M. J., Peper, S. M. Anal Chem. 80, 4070-4070 (2008).
  12. Autom, L. ab 11, 399-399 (2006).
  13. Petkovic-Duran, K., Manasseh, R., Zhu, Y. 47 (4), 827-827 (2009).
  14. Boon, W. C., Petkovic-Duran, K., White, K. 50 (2), 116-116 (2011).
  15. Liu, R. H., Lenigk, R., Druyor-Sanchez, R. L. Anal Chem. 75 (8), 1911-1911 (1911).
  16. Riley, N. Ann Rev Fluid Mech. 33, 43-43 (2001).
  17. Whitehill, J., Neild, A., Ng, T. W. Applied Physics Letters. 96 (5), 053501-053501 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Acoustic MicrostreamingReverse Transcriptase ReactionsSingle cell mRNAcDNA YieldsMicromixing TechniqueQuantitative PCRMicrofluidic MixingLaboratory ReagentsRNA DegradationGene Expression Analysis

מאמרים קשורים