מאמר שיטה

הערכת מצב הפלמיטוילציה של חלבוני קרום התא מרקמת מוח של עכבר

8 ביולי 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Speca, D. J., et al. בדיקת שינוי ג'ל Acyl-PEGyl לקביעה כמותית של פלמיטוילציה של חלבוני קרום המוח. J. Vis. Exp. (2020).

הסרטון מדגים את ניתוח מצב הפלמיטוילציה של חלבוני קרום התא המבודדים מרקמת מוח העכבר. התהליך כולל חשיפת הציסטאין הלא-פלמיטוילטי וחסימתם, ולאחר מכן שימוש בפולימר שנקשר לציסטאין הפלמיטוילטי, ומסייע בהערכת מצב הפלמיטוילציה של החלבונים המבודדים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבחינת אתיקה של בעלי חיים.

1. הכנת ממברנות מוח של עכברים

  1. ערפו את ראשו של העכבר באמצעות מכשיר גיליוטינה ונתחו את המוח במהירות (תוך <1 דקה, אם אפשר, כדי למזער את השינויים בפלמיטוילציה שעלולים להתרחש במהלך הליך הדיסקציה). הומוגניזציה מיידית ב-10 מ"ל של מאגר הומוגניזציה (טבלה 1) בהומוגנייזר זכוכית (~12 משיכות) על קרח.
  2. צנטריפוגה ליזטית למשך 15 דקות ב-1,400 x g ב-4 מעלות צלזיוס. השעו מחדש את הגלולה (~6 פעימות) בנפח שווה של מאגר הומוגניזציה וצנטריפוגה ב-710 x g למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  3. שלבו את הסופרנטנטים משלב 1.2 וצנטריפוגה ב-40,000 x g למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  4. השליכו את הסופרנטנט (השבר הציטוזולי) והשעו מחדש את שבר הממברנה הגלולה (P2) במאגר הומוגניזציה.
    הערה: ניתן להקפיא דגימות ולאחסן אותן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.
  5. בצע בדיקת חומצה ביסינצ'ונינית (BCA) כדי לכמת את רמות החלבון. עבור בדיקת Acyl-PEGyl החלפת ג'ל (APEGS), התחל עם ~100-200 מ"ג חלבון (מקסימום 250 מ"ג) בנפח של 470 מיקרוליטר של מאגר A (טבלה 1) בשפופרת של 1.5 מ"ל. סוניקט וצנטריפוגה ב->13,000 x g למשך 10 דקות ב-25 מעלות צלזיוס להסרת חלבון בלתי מסיס. העבירו חלבון מסיס לשפופרת חדשה של 1.5 מ"ל.

2. בדיקת Acyl-PEGyl exchange gel-shift (APEGS)

  1. לשבש קשרי דיסולפיד ולחסום ציסטאין חופשי.
    1. לשבש קשרי דיסולפיד על ידי דגירה ב-25 מ"מ טריס (2-קרבוקסיאתיל) פוספין (TCEP; 25 מיקרוליטר, בתוספת מתמיסת מלאי; טבלה 1) למשך 60 דקות ב-55 מעלות צלזיוס.
    2. ציסטאין נטול בלוקים עם 50 מ"מ N-אתילמלימיד (NEM; 12.5 מיקרוליטר, נוסף מתמיסת מלאי; טבלה 1) בטמפרטורת החדר למשך 3 שעות.
      הערה: ניתן להאריך את התגובה בן לילה.
  2. בצע משקעים של מתנול כלורופורם (CM).
    1. העבירו את תמיסת החלבון מצינור של 1.5 מ"ל לצינור פוליפרופילן או זכוכית שניתן לצנטריפוגה ברוטור דלי מתנדנד במהירות צנועה. צינור של 5 מ"ל הוא אידיאלי. הוסף ארבעה נפחים (2 מ"ל) של מתנול (MeOH) ומערבולת בקצרה.
    2. הוסף שני נפחים (1 מ"ל) של כלורופורם ומערבולת בקצרה.
    3. הוסף שלושה נפחים (1.5 מ"ל) של מים נטולי יונים (dH2O) ומערבולת בקצרה.
    4. צנטריפוגה את הדגימות ב-3,000 x g למשך 30 דקות ב-25 מעלות צלזיוס ברוטור דלי מתנדנד.
    5. הסר בזהירות והשליך את השלב העליון.
    6. מוסיפים 3 נפחים (1.5 מ"ל) של MeOH ומערבבים בעדינות אך ביסודיות, נזהרים לא לפצל את פנקייק החלבון האטום.
    7. צנטריפוגה ב-3,000 x g למשך 10 דקות ב-25 מעלות צלזיוס ברוטור דלי מתנדנד.
    8. בעזרת פיפט סרולוגי מזכוכית, הסר כמה שיותר מהשלב העליון מבלי להפריע לפנקייק החלבון.
    9. שטפו בזהירות את הגלולה עם 1 מ"ל MeOH.
    10. יבש את הגלולה באוויר למשך 10 דקות לפחות.
      הערה: ניתן לאחסן גלולה מיובשת בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
  3. לבצע מחשוף של קשרי פלמיטויל-תיואסטר עם הידרוקסילאמין (NH2OH, HAM).
    1. השעו מחדש את משקעי החלבון ב-125 מיקרוליטר של מאגר A וסוניקט לזמן קצר. צנטריפוגה ב->13,000 x g למשך 10 דקות ב-25 מעלות צלזיוס להסרת חומר בלתי מסיס. העבירו חלבון מסיס לשפופרת חדשה של 1.5 מ"ל.
    2. הוסף 375 מיקרוליטר של מאגר H (HAM+; טבלה 1) או מאגר T (HAM-; טבלה 1) ולדגור דגימות למשך 60 דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.
  4. חזור על משקעי ה-CM המתוארים בשלב 2.2.
    הערה: ניתן לאחסן גלולה מיובשת בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
  5. הוסף mPEG לציסטאין לא מוגן.
    1. השעו מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של מאגר A המכיל 10 מ"מ TCEP. מעבירים לצינור של 1.5 מ"ל.
      הערה: זה נורמלי שאובדן משמעותי של חלבון התרחש במהלך שלבי המשקעים של CM. כל השלבים הבאים יבוצעו בשפופרת של 1.5 מ"ל, המגבילים את נפח החלבון למקסימום של ~120-130 מיקרוליטר. זה יפחית את אובדן החלבון במהלך משקעי ה-CM הסופיים.
    2. הוסף 20 מ"מ mPEG-5k (25 μL, נוסף מתמיסת מלאי; טבלה 1) לדגימת חלבון ולערבב על ידי פיפטינג. דגירה למשך 60 דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס עם סיבוב מקצה לקצה.
    3. כדי להסיר mPEG-5k לא משולב, בצע משקעי CM כמתואר בשלב 2.2 באמצעות הנפחים המותאמים הבאים: 4 נפחים של MeOH (500 מיקרוליטר), 2 נפחים של כלורופורם (250 מיקרוליטר) ו-3 נפחים של dH2O (375 מיקרוליטר). צנטריפוגה ב->13,000 x g למשך 10 דקות ב-25 מעלות צלזיוס.
    4. הסר בזהירות את השלב העליון כמו קודם, הימנע מהפנקייק הסמיך והפלקולנטי. מוסיפים 1 מ"ל MeOH ומערבבים בעדינות אך ביסודיות. צנטריפוגה ב->13,000 x g למשך 10 דקות ב-25 מעלות צלזיוס.
    5. הסר בזהירות את הסופרנטנט ושטוף את הכדור עם 1 מ"ל MeOH. צנטריפוגה ב->13,000 x g למשך 10 דקות ב-25 מעלות צלזיוס.
      הערה: ניתן לאחסן גלולה מיובשת בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
    6. השעו מחדש את הגלולה המיובשת ב-50 מיקרוליטר של מאגר A (ללא TCEP או כל חומר מפחית).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טבלה 1: פתרונות המשמשים לבדיקת APEGS. ניתן להכין מאגר הומוגניזציה ומאגר A מבעוד מועד; עם זאת, יש להוסיף מעכבי פרוטאז ופניל-מתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF) מיד לפני השימוש. יש להכין את כל שאר הפתרונות טריים.

מאגררכיביםעובד conc.תגובות
הומוגנ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
הידרוקסילאמין (HAM) תרמו-פישר 26103
מתוקסי-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG)נוףME-050MAMW ~ 5000 kDa
מיקרופוגהאפנדורף5415R או ציוד שווה ערך
N-ethylmalemide (NEM)קלביוכם34115רעיל מאוד
הדמיה אופטית לדנסיטומטריהAzure Biosystemsהדמיה ביו-מולקולרית ספיר או ציוד שווה ערך
צינורות פוליפרופילן עם מכסהפישר סיינטיפיק14-956-1D
פיפטות סרולוגיות (זכוכית)פישר סיינטיפיק13-678-27D
צנטריפוגה שולחניתבקמןאלגרה X-15R או ציוד שווה ערך
טריס(2-קרבוקסיאתיל)פוספיןהידרוכלוריד (TCEP)EMD Millipore580560

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים