ייצור מיקרו-חרוזים פולימריים משחררי עמילואיד-בטא למידול מחלת אלצהיימר

תקציר

מקור: Almari, B., et al. ייצור מיקרו-חרוזי אלגינט המפרישים עמילואיד β לשימוש במידול מחלת אלצהיימר. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים שיטה לייצור מיקרו-חרוזים פולימריים העוטפים תאים מפרישי עמילואיד-בטא נוירוטוקסיים. תרחיף התא-פולימר מעובד באמצעות מכשיר לייצור מיקרו-חרוזים, כאשר ג'לציה פולימרית מושגת באמצעות קישור צולב של סידן, ויוצר מיקרו-חרוזים כדוריים סביב התאים. הפולימר מאפשר התפשטות תאים תוך שחרור מבוקר וארוך טווח של עמילואיד-בטא, המדמה את הצטברותו במחלת אלצהיימר.

פרוטוקול

1. הכנות

1. הכן 100 מ"ל של ~4% (w/v) תמיסת מלאי אלגינט.
   1. שקלו 4.4 גרם מלח נתרן אלגינט והוסיפו את האבקה היבשה ל-100 מ"ל של תמיסת מלח חוצצת HEPES (HBS, 20 מ"מ הידרוקסיאתילפיפרזין אתאן חומצה סולפונית [HEPES] (0.477 גרם) עם 150 מ"מ NaCl (0.877 גרם) במים נטולי יונים המאפשרים הידרציה.
   2. השתמשו במערבל מגנטי במהירות של ~500 סיבובים לדקה (סל"ד) וחממו עד 50 מעלות צלזיוס כדי לאפשר הידרציה מלאה של אלגינט><. הערה: ייתכן שהאלגינט זקוק לשעה או שעתיים כדי לקבל לחות מלאה. כדי לחסוך זמן, ניתן להמציא תמיסת אלגינט יום לפני פרוטוקול האנקפסולציה ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד למחרת. לאחר שהאלגינט נשמר בקירור, יש לחמם בעדינות ל-37 מעלות צלזיוס באמצעות אמבט מים או פלטה חשמלית ולערבב בעזרת מערבל מגנטי מיד לפני השימוש.
   3. מסנן סטרילי את תמיסת האלגינט באמצעות מסנן פוליאתרסולפון נקבובי (PES) של 0.22 מיקרומטר לפני השימוש. מומלץ לסנן ב-37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר זרימה קלה של אלגינט. הצמיגות תגדל אם נותנים לטמפרטורה לרדת.
2. הכן 1,000 מ"ל של 0.5 מ' CaCl₂.
   1. שוקל 55.49 גרם CaCl₂ נטול מים ומתמוסס ב-1,000 מ"ל של HBS (20 מ"מ HEPES ו-150 מ"מ NaCl ב-1,000 מ"ל מים נטולי יונים).
   2. מסנן סטרילי באמצעות מסנן PES נקבובי של 0.22 מיקרומטר.
3. הכן 100 מ"ל תערובת פירוק.
   1. הכינו תמיסת HEPES של 100 מ"מ (23.83 גרם) ו-500 מ"מ טריסודיום ציטראט דיהידראט (147.05 גרם) בתמיסת מלח עם חוצץ פוספט.
   2. התאימו ל-pH 7.4 באמצעות NaOH או HCl.

2. הגדרת מערכת האנקפסולציה

1. נקה את מכסה המנוע הלמינר.
   1. עקר את מכסה הזרימה הלמינרי המכיל את המעטפת באמצעות חשיפה ל-UV ואחריו ריסוס בתמיסת אתנול 70% v/v.
   2. שטפו את מערכת האנקפסולטור עם 10 מ"ל של תמיסת אתנול 70% v/v ואחריה 10 מ"ל מים סטריליים נטולי יונים.
   3. חבר את פיית 300 מיקרומטר וחזור על שלב 2.1.2.
   4. רססו את הבקבוק המכיל את תמיסת האלגינט המסוננת, את הבקבוק המכיל את תמיסת הסידן כלוריד המסוננת וכל כלים, ציוד וצלחות תרבית ריקות שישמשו עם תמיסת אתנול 70% v/v והנח אותם במכסה הזרימה הלמינרית. לפני השימוש, הפעל שוב נורת UV למשך 30 דקות כדי לעקר היטב.
   5. הכינו כוס פסולת מלאה בתמיסת חיטוי בדרגה ביולוגית והניחו את הכוס למכסה המנוע.
   6. ממלאים כוס ב-100 מ"ל תמיסה סטרילית CaCl₂ (מימית) ומוסיפים מערבל מגנטי. הגדר את מהירות הערבוב ל -100 סל"ד. הניחו את הכוס על פלטפורמה מגנטית בגובה 18 ס"מ מקצה הזרבובית. כוס זו תשמש לאיסוף חרוזי אלגינט ולאפשר את הג'לציה שלהם.
2. הכן תאים למעטפת.
   1. מוציאים תאים מהחממה ומנתקים מהבקבוק הקרוב באמצעות תמיסת חומצה טריפסין-אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA) של 0.25% ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות.
   2. בודד דגימה להערכת צפיפות התאים ולאחר מכן צנטריפוגה את התאים הנותרים ב-1,000 סל"ד למשך 5 דקות כדי להשיג גלולת תא.
   3. השעו מחדש את הגלולה ב-HBS (20 מ"מ HEPES ו-150 מ"מ NaCl) כדי להכפיל את ריכוז התאים הרצוי הסופי (למשל, לריכוז סופי של 1.5 x 10⁶ תאים/מ"ל, השעו מחדש את התאים ב-HBS כדי להשיג ריכוז של 3 x 10⁶ תאים/מ"ל).
   4. בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל, מערבבים את תרחיף התא ביחס של 1:1 עם תמיסת אלגינט ~4% (w/v) לקבלת תרחיף סופי המכיל את ריכוז התאים הרצוי (למשל, 1.5 x 10⁶ תאים/מ"ל) בתמיסת אלגינט ~2% (w/v).
3. הגדר את פרמטרי האנקפסולציה.
   1. הגדר את מהירות מכונת האנקפסולטור למהירות האקסטרוזיה המקסימלית (8.9 מ"ל/דקה), את המתח ל-1.0 קילו וולט ואת התדר ל-5,500 הרץ
      הערה: פרמטרים אלה עברו אופטימיזציה בעבר להשגת מיקרו-חרוזים בקוטר 550 מיקרומטר.

3. ייצור

1. לייצר את המיקרו-חרוזים.
   1. במזרק של 20 מ"ל, טען 5 מ"ל ממתלה התא-אלגינט והצמד מזרק למעטפת.
   2. הפעל את האנקפסולטור על ידי הפעלת הזרימה שתדחוף את מתלה התא-אלגינט דרך המזין. זרם טיפות יופעל דרך הזרבובית.
   3. אסוף את 1 המ"ל הראשונים בכוס הפסולת כדי למנוע את הזרם הראשוני הלא אחיד.
   4. המשיכו להפעיל את 4 המ"ל הנותרים ואפשרו לטיפות ליפול לאמבט הג'לציה CaCl₂. ניתן להפעיל כל מיליליטר בנפרד (אך ברצף) ולאסוף אותו בארבע אמבטיות ג'לציה שונות במידת הצורך.
      הערה: במגע עם אמבט הג'לציה, האלגינט בטיפות יתחבר באופן מיידי עם יוני הסידן באמבט הג'לציה ויוצר מיקרו-חרוזים כדוריים.
   5. לאחר דקה אחת, הסר את כוס הג'לציה מהפלטפורמה המגנטית ואפשר למיקרו-חרוזים לשבת במשך 4 דקות נוספות ללא תסיסה (זמן הכרחי כדי לאפשר ג'לציה מלאה על פני המיקרו-חרוזים בטמפרטורת החדר).
2. אחזר מיקרו-חרוזים.
   1. הסר כל פסולת או חפצים גדולים של אלגינט באמצעות זוג פינצטה סטרילית, ולאחר מכן השתמש בפיפטה מפלסטיק סטרילית כדי להעביר למסנן רשת של 74 מיקרומטר כדי לאחזר את המיקרו-חרוזים מאמבט הג'לציה.
   2. העבירו את המיקרו-חרוזים לצינור צנטריפוגה באמצעות מדיום התרבית המתאים ואפשרו להם להתייצב למשך 5 דקות במדיום תרבית התא.
   3. מעבירים לבקבוק, צלחת או צלחת פטרי לדגירה וניסויים נוספים.
      הערה: אין לעשות שימוש חוזר באמבטיית ג'לציה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.22 um PES filter	מרק, בריטניה	SLGP033RS
15mm Netwell insert 74 um mesh filter	Constar, usa	#3477
חומצה אלגינית מלח נתרן מאצות חומות	Sigma-Aldrich,uk	A0682
סידן כלורי	סיגמא-אולדריץ',uk	C1016
CellTiter96 AQueous One Solution מבחן התפשטות תאים	Promega, ארצות הברית	G3580
אנקפסולטור	אינוטק	IE-50	מס' סידורי 05.002.01-2005
HEPES	Sigma-Aldrich,uk	H4024
פוספט חוצץ מלח	Sigma-Aldrich,uk	D1408
נתרן כלורי	Sigma-Aldrich,uk	433209
טריספדיום ציטראט דיהידרט	Sigma-Aldrich,uk	W302600-K
פתרון טריפסין-EDTA	Sigma-Aldrich,uk	T4049