$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים והסקירה הווטרינרית של JoVE
הערה: התחל בזיהוי אוכלוסיית היעד של העכברים. במחקרים קודמים נעשה שימוש רק בעכברי בר זכרים מסוג C57/Bl6. עם זאת, ניתן להשתמש גם בעכברים טרנסגניים או נוקאאוט שונים. שימו לב שהקואורדינטות הסטריאוטקטיות מבוססות על האנטומיה של C57/Bl6. מומלץ שכל משתמש יוודא תחילה את הלוקליזציה של השבץ לחומר הלבן.
1. אינדוקציה של שבץ חומר לבן - גישה זוויתית מדיאלית
- התחל בהכנת פיפטת זכוכית משוכה באמצעות צינור נימי 0.5 מ"מ בקוטר דיסטלי בין 15-25 מיקרומטר.
- הכן מנה סטרילית של 10 מיקרוליטר של L-Nio (N(5)-(1)-iminoethyl-L-ornithine hydrochloride) ב-27.4 מ"ג/מ"ל (130 מיקרומטר) בתמיסת מלח סטרילית רגילה של 0.9%.
- מלאו מראש את פיפטת הזכוכית המשוכה בנפח קטן של L-Nio (2-5 מיקרוליטר) על ידי הצמדת פיפטת הזכוכית לצינורות המחוברים לקו ואקום. הנח את הפיפטה שטוחה על החלק העליון של הספסל והכנס את הקצה המשוך לתמיסת L-Nio.
- החל את הוואקום עד למילוי לפחות 2 מ"מ מהחלק של 0.5 מ"מ של הפיפטה. כבה את הוואקום ומשוך את הפיפטה. הניחו אותו בצד עד לשלב 1.12.
- הנח את העכבר בתא אינדוקציה וגרם להרדמה של העכבר באמצעות איזופלורן סטנדרטי של 32% הזורם דרך וופורייזר (5 ליטר לדקה בשאיפה עם 5 ליטר חמצן לדקה ו-0.5 ליטר חנקן לדקה) למשך דקה אחת או עד להרדמה עמוקה. העבר את העכבר למנגנון סטריאוטקטי המצויד במיקרוסקופ סטריאוטקטי. לספק הרדמה תחזוקתית באמצעות איזופלורן 32% המוזרם דרך וופורייזר (2 ליטר לדקה בשאיפה עם 5 ליטר חמצן לדקה ו-0.5 ליטר חנקן לדקה) וחרוט אף. בדוק את עומק ההרדמה עם צביטה בבוהן.
- כוונן את זרוע ההזרקה ל-36°.
- הצמד מחזיק פיפטה מזכוכית משוך לקצה הדיסטלי של מערכת הזרקת לחץ בנפח נמוך והצמד אותו לזרוע ההזרקה של המערך הסטריאוטקטי
- מצפים את השפם של החיה המורדמת בג'לי נפט ומניחים משחת דמעות מלאכותית על שתי העיניים. הכינו שדה כירורגי סטרילי על ידי הנחת וילון סטרילי על ראש החיה עם פתח של 5-10 ס"מ מעל הראש. הכן משטח כירורגי אספטי על ידי גילוח הפרווה המכסה את הגולגולת. נקו את הקרקפת עם בטדין ו-70% אלכוהול לסירוגין.
- בצע חתך של 1.5 ס"מ בקו האמצע של הקרקפת עם מספריים עדינים סטריליים כדי לחשוף את פני הגולגולת. יבש את הגולגולת עם צמר גפן סטרילי, ובאמצעות מיקרוסקופ סטריאוטקטי בהגדלה של פי 1-3, הסר כל רקמה פריאוסטאלית שמעליו באמצעות כלי מיקרו-נקודה סטרילי.
- סמן את הברגמה כנקודת ייחוס באמצעות סמן נקודה עדין.
- קדחו קרניוטומיה אליפטית של 2 מ"מ באמצעות מקדח כירורגי סטרילי עדין המתחיל מאחור בברגמה ונמשך מלפנים ממש משמאל לקו האמצע. הסר שברי עצם ורקמות רכות מעל כך שניתן יהיה לדמיין את קליפת המוח.
- שמור על לחות שדה הניתוח ומשטח קליפת המוח על ידי מריחה לסירוגין של מי מלח סטריליים.
- הצמד פיפטת זכוכית משוכה לזרוע המזרק של המנגנון הסטריאוטקטי. יישר את הקצה הדיסטלי של הפיפטה עם הברגמה ואפס את הקואורדינטות הסטריאוטקטיות.
- קדם את הפיפטה לקואורדינטות הקדמיות/אחוריות (A/P) והמדיאליות/רוחביות (M/L) הראשונות המסופקות ב-טבלה 1.
- קדם את הפיפטה למשטח קליפת המוח ואפס את מדידת הגב/גחון (D/V).
- העבירו את הפיפטה לאט לתוך המוח עד שתגיעו לקואורדינטת D/V הראשונה ב-טבלה 1.
- באמצעות מערכת הזרקת לחץ בנפח נמוך המוגדרת על 20 psi עבור פולסים של 20 msec, הזרקו 100 nl של L-Nio למוח והמתינו 5 דקות כדי למנוע ריפלוקס במעלה מסלול הפיפטה.
- השתמש ברטיקל מכויל בעינית המיקרוסקופ הסטריאוטקטי ובהגדלה של פי 3.
- בהתאם לכך, הזז סך של 0.100 מ"מ3 (אורך 0.5 מ"מ בפיפטה בקוטר 0.5 מ"מ, המתאים ל-100 נ"ל) מפיפטת הזכוכית הנמשכת עבור כל קבוצת קואורדינטות. על ידי שימוש ברשת, מדוד ותקן מכיוון שכל הגדרה משתנה בהתאם להגדלה ולקנה המידה בו נעשה שימוש.
- למדידת נפח מדויקת במהלך כל הזרקה, התקרב לפיפטה הזוויתית עם המיקרוסקופ מהצד כך שלמניסקוס נוזל האוויר תהיה ראייה סגיטלית. המניסקוס צריך להופיע באותו מישור מוקד של הקירות הפנימיים והחיצוניים של הפיפטה.
- משוך לאט את הפיפטה וחזור על שלבים 1.13-1.16.3 בקבוצת הקואורדינטות השנייה והשלישית המסופקות ב-טבלה 1.
- לאחר ההזרקה האחרונה, הסר את הפיפטה והניח מספיק שעוות עצם כדי למלא את אתר הגולגולת. יש להעריך את קצוות הפצע בקרקפת ולקשור אותו עם דבק עורי.
- יש להזריק 0.1 מ"ל של 0.5% מרקאין לשולי הפצע באמצעות מחט סטרילית של 30 גרם למניעת כאבים מקומיים הקשורים לחתך בקרקפת.
- יש להחזיר את בעל החיים לדיור ולספק אנטיביוטיקה לאחר הניתוח (0.48 מ"ג/מ"ל טרימתופרים-סולפאמתוקסזול או 0.5 מ"ג/מ"ל לבופלוקסצין) במי השתייה למשך 5 ימים.
