איתור אינטראקציות חלבון-חלבון בזחלי דרוזופילה באמצעות בדיקת קשירת קרבה

תקציר

מקור: Wang, S., et al. זיהוי של באתרו קומפלקסים של חלבון-חלבון בצומת העצבי-שרירי של Drosophila באמצעות בדיקת קשירת קרבה. J. Vis. Exp. (2015).

סרטון זה מדגים את ההדמיה של אינטראקציות חלבון-חלבון בצומת העצבי-שרירי Drosophila (NMJ) באמצעות בדיקת קשירת קרבה (PLA). לאחר בידוד דפנות הגוף, חלבונים המקיימים אינטראקציה נבדקים עם נוגדנים ראשוניים ונוגדנים משניים מצומדים PLA. הקרבה של החלבונים האינטראקטיביים מקלה על קשירת בדיקות עם אוליגונוקלאוטידים מחברים, ויוצרים DNA מעגלי, אשר מוגבר לאחר מכן על ידי הגברת מעגל מתגלגל. בדיקות פלואורסצנטיות נקשרות ל-DNA המוגבר, ומאפשרות הדמיה של אינטראקציות חלבון-חלבון ב-NMJ.

פרוטוקול

1. הכנת דופן הגוף

הערה: הכנת דפנות גוף הזחל בדרגה שלישית (לחקר ה-NMJs המעצבבים את שרירי דופן הגוף) בוצעה כפי שתואר קודם לכן אך עם כמה שינויים.

1. דיסקציה
   1. הרם את מלאי הזבובים והצלבים ב-25 מעלות צלזיוס למשך חמישה עד שישה ימים באמצעות נהלים סטנדרטיים.
   2. בחרו זחלי כוכב שלישי זוחלים מבקבוקונים או בקבוקים באמצעות מלקחיים עדינים.
   3. שטפו את הזחלים בצלחת פטרי קטנה המכילה מי מלח פוספט (PBS) כדי להסיר חלקיקי מזון.
   4. הניחו זחל בודד על דיסק סילגרד וטבלו אותו בכמה טיפות PBS קר כקרח. שימוש ב-PBS קר כקרח יעזור להמם את הזחל ויקל על המניפולציה. לאורך כל הדיסקציה, ודא שהתכשיר שקוע תמיד ב-PBS כדי למנוע את התייבשותו.
   5. מקמו את הזחל כשהצד הגבי שלו פונה כלפי מעלה כך ששני דרכי קנה הנשימה נראים תחת מיקרוסקופ מנתח (איור 1A). השתמשו במלקחיים כדי לתפוס סיכה זעירה, הצמידו את הזחל כלפי מטה בקצה האחורי ליד הספירקלים (איור 1B). בעזרת סיכה נוספת, חודרים דרך הציפורן בקצה הקדמי ליד ווי הפה. מתחו בעדינות את הזחל לאורכו, ואז הצמידו אותו כלפי מטה (איור 1B).
   6. בעזרת מספריים מיקרו-דיסקציה, צבט את הקצה האחורי ליד הסיכה כדי ליצור פתח קטן. החתך צריך להיות שטחי מספיק כדי פשוט לעבור דרך הציפורן.
   7. מכניסים את קצה הלהב התחתון של המספריים לתוך החתך, חותכים לכל אורך קו האמצע הגבי בין שתי דרכי קנה הנשימה (איור 1C). כוון את להבי המספריים מעט כלפי מעלה בעת החיתוך כדי למנוע פגיעה בשרירי דופן הגוף הגחוניים.
   8. בצע חתך אופקי קטן מעט קדמי לסיכה הממוקמת מאחור ( איור 1C). בצע חתך דומה נוסף מעט אחורי לסיכה הממוקמת קדמית (איור 1C). החתכים צריכים פשוט לעבור דרך הציפורן.
      הערה: שלושת החתכים משלבים 1.1.7 ו-1.1.8 ביחד צריכים להיות דומים ל-"" בהשלמתם, כלומר{, יש לייצר דש שמאלי וימני בצד הגבי של גוף הזחל.
   9. יש לנקות בזהירות את האיברים הפנימיים בעזרת המלקחיים. הוספת כמה טיפות חזקות של PBS תעזור לעקור את האיברים מגוף הזחל, ובכך תקל על הסרתם הימנע מדקירת גוף הזחל מכיוון שהוא יגרום נזק לשרירי דופן הגוף.
   10. פתחו את גוף הזחל והצמידו את הפינות כלפי מטה (איור 1D). בעת הצמדה, מתחו את דופן הגוף הן אופקית והן אנכית כדי ליצור מלבן מתוח באופן שווה (ראו איור 1G לצורה), תוך הקפדה לא לקרוע את שרירי דופן הגוף בתהליך.
   11. סיימו להסיר את כל האיברים הפנימיים שנותרו (איור 1E).
2. קיבוע וחדירות
   1. טבלו את קירות הגוף המוצמדים בכמה טיפות של Bouin's Solution. דגירה למשך 15 דקות על קרח. לחלופין, השתמש ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) כקיבוע חלופי; דגירה למשך 30 דקות.
   2. יש לשטוף שלוש פעמים עם תמיסת מלח פוספט עם טריטון (PBT).
   3. בעזרת מלקחיים עדינים, הסר בזהירות את הסיכות והעביר את דפנות הגוף בפינותיהם לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה סיליקון של 0.65 מ"ל.
   4. אחסן את דפנות הגוף ב-PBT ב-4 מעלות צלזיוס עד שיהיה מוכן ל-PLA. לקבלת תוצאות מיטביות, התחל לצבוע את דפנות הגוף תוך יום או יומיים מרגע הדיסקציה.
      הערה: כדי לחסוך בריאגנטים וכדי להבטיח שכל דפנות הגוף יטופלו באופן שווה במהלך הבדיקה, ניתן להכניס גנוטיפים שונים לצינור אחד. ניתן להבחין בין גנוטיפים על ידי חיתוך פינות דפנות הגוף בצורה שונה (ראו איור 1F למשל).

2. אימונוהיסטוכימיה

הערה: צביעה חיסונית של דפנות גוף הזחל של הכוכב השלישי בוצעה כפי שתואר קודם לכן אך עם כמה שינויים.
הערה: בצע את כל השלבים בטמפרטורת החדר ובתסיסה עדינה, אלא אם צוין אחרת.

1. חסימת
   1. שטפו את קירות הגוף עם PBT שלוש פעמים למשך 10 דקות כל אחד.
   2. יש לחסום עם אלבומין סרום בקר 1% (BSA) למשך שעה.
2. צביעה חיסונית
   1. דגרו על דפנות הגוף עם נוגדנים ראשוניים של עכבר וארנב כנגד שני החלבונים המעניינים (מדוללים ב-1% BSA) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר, או לילה ב-4 מעלות צלזיוס. במקרה זה, השתמש ב-1:10 עכבר נגד Dlg (Dlg = דיסקים גדולים) ו-1:250 ארנב נגד HtsM (HtsM: מוטנט Hu-li tai shao). ניתן לכלול גם נוגדנים נגד סמנים שאינם מיוצרים בעכבר או בארנב - לדוגמה, השתמש ב-1:200 עזים נגד Hrp (Hrp = חזרת פרוקסידאז) כדי לתאר את הממברנות העצביות.
   2. יש לשטוף עם PBT שלוש פעמים למשך 10 דקות כל אחת.
   3. דגירה עם נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור כדי לזהות את הסמנים (מדוללים ב-1% BSA) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר, או לילה ב-4 מעלות צלזיוס. מכיוון שאות ה-PLA מודגם מאוחר יותר עם פלואורופור אדום, יש להשתמש בפלואורופור אחר כדי לזהות את הסמן - למשל, השתמש ב-1:200 פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC) מצומד נגד עז כדי לזהות את הנוגדן נגד Hrp של העז. בשל השימוש בריאגנטים רגישים לאור, שמור את הצינורות בחושך מנקודה זו ואילך.
      הערה: הערכה המשמשת מאפשרת לבצע PLA בין נוגדנים ראשוניים הגדלים בעכבר ובארנב, כאשר האות מוקרן על הערוץ האדום במיקרוסקופיה קונפוקלית. אם תרצה, קיימות ערכות אחרות המאפשרות לבצע את הבדיקה עם נוגדנים ראשוניים שגודלו במינים אחרים, והאות מוקרן בערוצים אחרים.

3. בדיקת קשירת קרבה

הערה: בצע את כל השלבים בטמפרטורת החדר ובתסיסה עדינה אלא אם צוין אחרת.

1. בדיקות PLA
   1. שטפו את קירות הגוף עם PBT שלוש פעמים למשך 10 דקות כל אחד.
   2. דגירה עם בדיקות PLA (דילול של 1:5 כל אחת ב-1% BSA) למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס. במקרה זה, השתמש ב-40 מיקרוליטר של בדיקת PLA נגד עכבר MINUS, 40 מיקרוליטר של בדיקת PLA נגד ארנב PLUS ו-120 מיקרוליטר של 1% BSA כדי להבטיח טבילה וערבוב נאותים של 5-10 קירות גוף. דילול של עד 1:25 של בדיקות ה-PLA עדיין יכול לגרום ליחס אות לרעש הולם ( כלומר, עבור ניסוי זה).
2. קשירה
   1. שטפו את דפנות הגוף עם Wash Buffer A פעמיים למשך 5 דקות כל אחד.
   2. יש לדגור עם תמיסת קשירה (דילול של 1:40 של ליגאז במאגר קשירה) למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. במקרה זה, השתמש ב-5 מיקרוליטר של ליגאז, 40 מיקרוליטר של מאגר 5 קשירה ו-155 מיקרוליטר של מים בטוהר גבוה כדי להבטיח טבילה וערבוב נאותים של 5-10 דפנות גוף.
3. הגברה
   1. שטפו את דפנות הגוף עם Wash Buffer A פעמיים למשך 2 דקות כל אחד.
   2. דגירה עם תמיסת הגברה (דילול 1:80 של פולימראז במאגר הגברה) למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס. במקרה זה, השתמש ב-2.5 מיקרוליטר של פולימראז, 40 מיקרוליטר של 5 מאגר הגברה ו-157.5 מיקרוליטר של מים בטוהר גבוה כדי להבטיח טבילה וערבוב נאותים של 5-10 דפנות גוף.
4. הכנה להדמיה
   1. שטפו את דפנות הגוף עם Wash Buffer B פעמיים למשך 10 דקות כל אחת.
   2. שטפו עם 0.01x Wash Buffer B פעם אחת למשך דקה אחת.
   3. יש לאזן בכמה טיפות של תמיסת הרכבה למשך 30 דקות לפחות לפני ההרכבה, או לאחסן למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   4. בעזרת מלקחיים עדינים, העבירו בזהירות את דפנות הגוף למגלשת פלטפורמה כשהציפורניים פונות כלפי מטה. מקם את קירות הגוף בשורות ובאותו כיוון בתוך טיפה או שתיים של תושבת. הניחו כיסוי בגודל 22 מ"מ על 40 מ"מ מעל התכשיר תוך הקפדה לא ליצור בועות אוויר, ולאחר מכן אטמו את השקופית עם לק שקוף.
   5. אחסן את השקופיות בחושך בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד שהן מוכנות להדמיה קונפוקלית.

תוצאות

איור 1: הכנת דפנות גוף זחל כוכב שלישי. (א-ו) שרטוטים סכמטיים המייצגים דיסקציה של דופן הגוף. (A) הנח זחל בודד על דיסק סילגרד כשצדו הגבי פונה כלפי מעלה כך ששני דרכי קנה הנשימה נראים לעין. (B) הצמידו את הזחל כלפי מטה בקצוות הקדמיים והאחוריים בעזרת סיכות זעירות, מותח את הזחל לאורכו בתהליך. (C) בצע שלושה חתכים בצד הגבי של גוף הזחל עם מספריים מיקרו-דיסקצ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מלקחיים (בסדר #5)	אלמדיק	A10-704
דיסק סילגארד	מכשירי דיוק עולמיים	SYLG184	מערבבים בסיס אלסטומר וחומר ריפוי ביחס של 10:1. מוגדר למשך 30 דקות. יוצקים לתבנית (למשל השתמשו בצלחת תרבית תאים עם 12 בארות). יש להניח לריפוי למשך 24 שעות לפחות. היצמדו למכסה של מכסה צלחת פטרי בגודל 60x15 מ"מ בעת הניתוח.
פינים זעירים (קוטר קצה 0.0125 מ"מ)	כלים מדעיים	26002-10
מספריים מיקרו-דיסקציה (עדינים במיוחד)	כלים מדעיים	15200-00
שקופיות פלטפורמה			הדביקו שני כיסויים בגודל 22x22 מ"מ על שקופית מיקרוסקופ עם לק שקוף, והשאירו רווח של <20 מ"מ ביניהם להרכבת דגימה.
w1118	מרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה	3605
hts01103	מרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה	10989	המלאי אוזן מחדש על גבי מאזן GFP כך שניתן יהיה לבחור מוטציות הומוזיגוטיות על סמך היעדר אות GFP.
1x PBS (Phosphate Buffered Saline): 3mM NaH2PO4, 7mM Na2HPO4, 130mM NaCl, pH 7.0			NaH2PO4 (מעבדות קלדון - 8180-1), Na2HPO4 (קלדון - 8120-1), NaCl (קלדון - 7560-1)
הפתרון של בואן	סיגמא-אולדריץ'	HT10132
4% PFA (פרפורמלדהיד): 4% PFA ב-1x PBS			PFA (מדע אנכימיה - 66194-300). ראה doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 להוראות כיצד להכין את הפתרון.
1x PBT (פוספט חוצץ מלח עם טריטון): 1x PBS עם 0.01% טריטון			Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787)
1% BSA (אלבומין בסרום בקר): 1% BSA ב-1x PBT			BSA (ביושופ קנדה - ALB001). יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
עכבר נגד Dlg (דיסקים גדולים)	בנק היברידומה למחקרים התפתחותיים	4F3	יש להשתמש בדילול של 1:10 ב-1% BSA.
ארנב אנטי-HtsM (הו-לי טאי שאו)			מסופק על ידי ד"ר לין קולי (אוניברסיטת ייל). יש להשתמש בדילול של 1:250 ב-1% BSA.
ארנב אנטי-פאק (p21-activated kinase)			מסופק על ידי ד"ר ניקולס הארדן (אוניברסיטת סיימון פרייזר). יש להשתמש בדילול של 1:500 ב-1% BSA.
עכבר נגד WG (ללא כנפיים)	בנק היברידומה של מחקרים התפתחותיים	4D4	יש להשתמש בדילול של 1:5 ב-1% BSA.
עז נגד Hrp (חזרת פרוקסידאז)	ג'קסון אימונוסקר	123-065-021	יש להשתמש בדילול של 1:200 ב-1% BSA.
חמור מצומד נגד עז	Jackson ImmunoResearch	705-095-003	יש להשתמש בדילול של 1:200 ב-1% BSA.
Duolink In Situ PLA Probe נגד עכבר MINUS	סיגמא-אולדריץ'	DUO92004
Duolink In Situ PLA Probe anti-rabbit PLUS	סיגמא-אולדריץ'	DUO92002
ריאגנטים לזיהוי Duolink באתרם אדום	סיגמא-אולדריץ'	DUO92008
1x מאגר כביסה A: 0.01M Tris, 0.15M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4	סיגמא-אולדריץ'	DUO82049	טריס (מעבדות קלדון - 8980-1), NaCl (קלדון - 7560-1), טווין 20 (פישר סיינטיפיק - BP337)
1x מאגר כביסה B: 0.2M Tris, 0.1M NaCl, pH 7.5	סיגמא-אולדריץ'	DUO82049	טריס (מעבדות קלדון - 8980-1), NaCl (קלדון - 7560-1)
0.01x מאגר כביסה B: 2mM Tris, 1mM NaCl, pH 7.5	סיגמא-אולדריץ'	DUO82049	טריס (מעבדות קלדון - 8980-1), NaCl (קלדון - 7560-1)
מדיום הרכבה Duolink באתרו עם DAPI	סיגמא-אולדריץ'	DUO82040