מאמר שיטה

קביעת יכולת אגירת הסידן של מיטוכונדריה מבודדת

8 ביולי 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Li, W., et. al. בדיקת קיבולת שימור מיטוכונדריאלית Ca2+ ובדיקת נפיחות מיטוכונדריאלית המופעלת על ידי Ca2+. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים את ההליך להערכת יכולת שימור הסידן במיטוכונדריה על ידי ניטור שינויים בזמן אמת בקרינה כאשר המיטוכונדריה סופגת סידן. בדיקה זו שימושית לחקר תפקוד המיטוכונדריה ותהליכים הקשורים לסידן, כולל אפופטוזיס ומחלות ניווניות.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. קביעת יכולת שימור Ca2+ מיטוכונדריאלית

  1. הכן את מדיית KCl (125 מ"מ KCl (אשלגן כלורי), 2 מ"מ K2HPO4 (דיפוטסיום פוספט), 1 מ"מ MgCl2 (מגנזיום כלוריד), 20 מ"מ HEPES (2-[4-(2-הידרוקסיאתיל)פיפרזין-1-יל] חומצה אתנסולפונית), 5 מ"מ גלוטמט, 5 מ"מ מלאט ו-2 מיקרומטר רוטנון, pH 7.4) והוסף את הצבע הפלואורסצנטי הירוק קושר Ca2+ לריכוז סופי של 0.5 מיקרומטר לפני הניסוי.
  2. העבר 1 מ"ל של מיטוכונדריה מבודדת (0.4 מ"ג/מ"ל) במדיה KCl המכילה 0.5 מיקרומטר Ca2+ צבע פלואורסצנטי ירוק מחייב לכל באר צלחת בת 6 בארות.
  3. לדגור את המיטוכונדריה ואת הצבע הפלואורסצנטי הירוק הקושר Ca2+ בצלחת 6 הבארות בטמפרטורת החדר, מוגן מאור הסביבה למשך דקה אחת. הוסף 4 מיקרוליטר של תמיסת CaCl2 (סידן כלורי) של 20 מ"מ (20 מ"מ CaCl2, 127 מ"מ KCl, 1 מ"מ MgCl2, 20 מ"מ HEPES, 5 מ"מ גלוטמט, 5 מ"מ מלאט, pH 7.4) לכל באר צלחת של 6 בארות באמצעות הגדרת החלוקה האוטומטית כדי להכניס 200 ננומול Ca2+/מ"ג חלבון מיטוכונדריאלי.
  4. השתמש בספקטרומטר פלואורסצנטי כדי לנטר את שינויי הקרינה כל 3 שניות למשך 2 דקות עם אורך גל עירור של 506 ננומטר ואורך גל פליטה של 531 ננומטר. הלוח מצויד בטלטול ב-600 סל"ד למשך 3 שניות בין קריאות הנשלטות על ידי תוכנה (איור 1).
  5. הוסף תוספת של 4 מיקרוליטר של תמיסת CaCl2 של 20 מ"מ לכל באר ועקוב אחר שינויי הקרינה כל 3 שניות למשך 2 דקות. חזור על שלב זה עד שהפלואורסצנטיות גדלה עם הזמן.
    הערה: המיטוכונדריה מאותגרת עם תוספת Ca2+ המצוינת על ידי הקרינה המוגברת של ההקלטה. כאשר ה-mPTP (נקבובית מעבר חדירות מיטוכונדריאלית) נפתחת, הקרינה גדלה עם הזמן.
  6. פרש את הכמות הכוללת של Ca2+ שנוספה עד לפתיחת ה-mPTP כקיבולת השמירה של Ca2+.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
איור 1: הגדרות התוכנה עבור Ca מיטוכונדריאלי Ca2+ בדיקת קיבולת שימור.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
סידן ירוק-5Nטכנולוגיות חייםc-3737צבע פלואורסצנטי ירוק קושר סידן
גלוטמטסיגמא-אולדריץ'RES5063G-A7
מלאטסיגמא-אולדריץ'46940-U
רוטנוןסיגמא-אולדריץ'R8875
HEPESסיגמא-אולדריץ'H3375
מגנזיום כלורידסיגמא-אולדריץ'457
דיפוטסיום פוספטסיגמא-אולדריץ'V900050
KClסיגמא-אולדריץ'P9541
סידן כלוריסיגמא-אולדריץ'V900266

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים