$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.
1. הכנת מערכות עירוי משאבה מיקרו-אוסמוטית
הערה: הכינו את המשאבה, מאגר נוזל המוח השדרתי המלאכותי (aCSF) והתרופה (תמיסת חלבון Met-CCL5/RANTES (10 ננוגרם/מ"ל ב-aCSF)) בתנאים סטריליים באמצעות מאגרים המסוננים עם מסננים של 0.2 מיקרומטר ובצעו את כל ההליכים מתחת למכסה המנוע עם כפפות. הליכי הניתוח מתבצעים באופן הבא:
- הכן את המשאבות המיקרו-אוסמוטיות יום לפני הניתוח: מלא את המשאבה המיקרו-אוסמוטית של המוח בנוזל מוחי מלאכותי (aCSF) עם מזרק של 1 מ"ל ומחט ראש קהה המסופקת יחד עם הערכה. טבלו את המשאבה המיקרו-אוסמוטית ב-aCSF והניחו אותה על שייקר עם ניעור עדין למשך הלילה.
זהירות: יש למלא את המשאבה ב-aCSF, ולהימנע מבועות אוויר בתוך המשאבה (איור 1A).
- לפני תחילת הניתוח, הכינו את תמיסת החלבון הרקומביננטית Met-CCL5/RANTES (10 ננוגרם/מ"ל, מדולל ב-aCSF) לניסוי. הסר את aCSF מהמשאבה ומלא את המשאבה בתמיסת התרופה באיטיות עד שעודף דולף החוצה.
הערה: 15 מ"ל aCSF או תמיסת Met-CCL5/RANTES מספיקה ל-5-8 משאבות.
זהירות: חזור על ההליך כדי להבטיח שהמשאבה מלאה לחלוטין בתרופה ללא בועות בפנים.
- חותכים את צינורות הצנתר לאורך הרצוי ומחברים אותם למחט עירוי המוח הקהה של ערכת עירוי המוח. מלאו את ערכת העירוי והצינורות בתרופה.
- לבסוף, הרכיבו והצמידו את ערכת עירוי המוח למשאבה המיקרו-אוסמוטית.
זהירות: אין ליצור בועות בצינור או במשאבה (איור 1A).
- טבלו את כל היתוך המשאבה-מוח האוסמוטי ב-aCSF בצינור מעוקר של 50 מ"ל כדי למנוע את התייבשות המשאבה. ערכת האיחוי האוסמוטית של המשאבה-מוח מוכנה כעת לשימוש לניתוח.
הערה: ניתן להשתמש במערכות המשאבות המיקרו-אוסמוטיות לעירוי תרופות לטווח ארוך. זה מבטיח דרך בטוחה ונוחה של העברת תרופות למוח העכבר.
2. כירורגיה חדרית תוך מוחית – השתלת המשאבה המיקרו-אוסמוטית
זהירות: עקר את סביבת הניתוח עם 75% אתנול וודא שהאנשים המעורבים במחקר לובשים כפפות סטריליות וחלוק מעבדה נקי. יש לבצע חיטוי ולייבש כלים/מכשירים כירורגיים לפני השימוש ולאחר מכן לעקר אותם עם 75% אתנול בין ניתוחי עכברים.
- שקלו את העכבר והרדימו אותו באמצעות הזרקה תוך-צפקית (IP) עם קטמין/קסילזין (קטמין 50 מ"ג/ק"ג, קסילזין 10 מ"ג/ק"ג).
זהירות: משקל גוף של עכברים נמוך מ-24 גרם אינו מומלץ לניתוח השתלת משאבה אוסמוטית.
- הרכיבו וקבעו את ראש העכבר על המנגנון הסטריאוטקטי (איור 1B).
- השתמש בזוג מספריים וצבתות כירורגיות כדי לחתוך את העור החיצוני המכסה את הגולגולת. השתמש ביוד כדי לנקות את הגולגולת ההיקפית.
- הפרידו את שכבת העור החיצונית ביותר מהעור התת-עורי בעזרת זוג צבתות עם ראש קהה ליד אזור הצוואר עבור השתלת ערכת איחוי מוח אוסמוטית (איור 1C).
- סמנו את נקודת העירוי בהתייחס למפת המוח ( איור 1D) באמצעות המנגנון הסטריאוטקטי. בניסוי זה, המחט צריכה להיות מושתלת באזור החדר 3rd (ברגמה: 0.0 מ"מ לרוחב, 1.3 מ"מ אחורי, 5.7 מ"מ גחון).
- קדחו חור באמצעות מקדחת מסמר סביב האזור המסומן על הגולגולת (איור 1E).
זהירות: היזהר לא לשבור את קרומי המוח וכלי הדם של העכבר, ובכך להימנע מהפרעה של כלי דם זעירים במוח.
- הניחו את ערכת האיחוי המיקרו-אוסמוטית של המשאבה-מוח שמכילה aCSF (כביקורת) או תרופה (תמיסת חלבון Met-CCL5/RANTES) מתחת לעור מאחורי אזור הצוואר, והכניסו את מחט עירוי המוח לתוך החור הקדוח כדי להחדיר את התרופה למוח העכבר (איור 1E). המחט תחדור לקרומי המוח ותיכנס לחדר. קבע את המחט במקומה על הגולגולת באמצעות ג'ל מפחית רגישות פני השטח ( איור 1F) והמתן 1-2 דקות עד שהדבק יתייבש. לאחר מכן, חתכו את החלק המקרין על גבי המחט (איור 1G-H).
- השתמש בדבק דבק רקמות כדי לרפא את פצע הניתוח בראש. מרחו 50 מיקרוליטר של הדבק על גבי הפצע, משכו את שני צידי העור יחד והחזיקו במשך 30 שניות כדי לאפשר לעור לאטום ( איור 1I).
זהירות: השתמש בפד 100% אלכוהול כדי לנקות את הפצע לאחר הניתוח ו-100 ul פניצילין עם סטרפטומיצין כדי למנוע זיהום. הערה: עור העכבר ייצור רקמת צלקת ויתרפא תוך מספר ימים לאחר מתן הדבק הכירורגי. היתרון העיקרי של הדבק הוא הימנעות מתפרים כירורגיים, העלולים לגרום לגירוי בעור או לדלקת.
- הניחו את העכבר בכלוב נקי השמור על צלחת חמה (מחוממת עד 37 מעלות צלזיוס) והמתינו עד שהעכבר יתאושש מאפקט ההרדמה.
זהירות: זה קריטי לשמור על טמפרטורת הגוף של העכבר כדי לשפר את סיכויי ההישרדות לאחר הניתוח.
- לאחר תקופת החלמה של שבוע, העכברים יהיו מוכנים לניסויים נוספים, כגון בדיקת סבילות לגלוקוז דרך הפה (OGTT) ובדיקת סבילות לאינסולין (ITT).
3. בדיקת סבילות לגלוקוז דרך הפה (OGTT)
הערה: בצע את בדיקת הסבילות לגלוקוז דרך הפה 7 ימים לאחר עירוי aCSF ו-MetCCL5/RANTES (10 ננוגרם/מ"ל, 100 מיקרוליטר). שמור על צום של 6 שעות לעכברים לפני OGTT עם אספקת מים מספקת. החזיקו את בעלי החיים על אותו שולחן עבודה שבו יבוצעו הניסויים כדי שיוכלו להתאקלם בסביבה כדי להפחית את הלחץ במהלך ההליך.
- הכנת תמיסת גלוקוז: לפני ביצוע הניסוי, הכינו את תמיסת הגלוקוז על ידי המסת 3.75 גרם גלוקוז ב-15 מ"ל של H2O.
- הגדר לוח זמנים לרישום הקריאות במהלך הליך הניסוי (טבלה 1).
הערה: חשוב להגדיר לוח זמנים עם מרווחים מתאימים בין כל בדיקת דם כדי לאפשר רישום מדויק במהלך הניסוי.
- שקלו כל עכבר לאחר הצום וחשבו את כמות הגלוקוז המתאימה להזרקה. לדוגמה, אם העכבר שוקל 30 גרם, כמות תמיסת הגלוקוז שתינתן צריכה להיות 300 מיקרוליטר.
- הכן את המכשירים הבאים ליד שולחן העבודה:
- גלוקומטר (לחץ על לחצן ההתחלה כדי לבדוק את מצב הסוללה; ודא שהיא פועלת לפני הבדיקה.)
- שבב גלוקוז
- מזרק אינסולין (0.3 מ"ל מזרק אינסולין)
- סכיני גילוח
- טיימר
- לאחר הגדרת הספסל, מדדו ורשמו את רמת הגלוקוז בדם באופן הבא: הכניסו שבב גלוקוז נקי וחדש לגלוקומטר ולחצו על כפתור ההתחלה כדי לאפס אותו.
- הרימו את העכבר בחלק האחורי של הצוואר ולטפו את הזנב כמה פעמים כדי להבטיח זרימת דם מספקת לאזור הזנב.
- שימוש בסכין גילוח חדש כדי לחתוך חתיכה קטנה מהזנב ולסחוט טיפת דם קטנה אחת (כ-10-20 מיקרוליטר) לתוך שבב הגלוקוז. הדם צריך למלא את השבב כדי לאפשר מדידה מדויקת. הגלוקומטר יציג את רמת הסוכר באופן מיידי. אם המכונה מראה "שגיאה", חזור על ההליך עם שבב סוכר חדש.
הערה: שבב הגלוקוז דורש רק טיפת דם אחת. כאשר יש צורך לאסוף את דגימת הדם יותר מפעם אחת, פשוט הפעילו לחץ על ידי העברת האצבעות לאורך זנב העכבר מספר פעמים תוך החזקת קצה הזנב ישירות על גבי השבב כדי לאסוף דם. אין צורך לחתוך את קצה הזנב בכל פעם בזמן איסוף דגימות דם.
- לאחר מכן, האכילו את העכברים בגלוקוז (0.25 גרם/מ"ל) דרך הפה באמצעות טכניקת הגאווז התוך-קיבתי. יש לחשב את כמות הגלוקוז שיש לתת באמצעות הנוסחה: 10X משקל גוף (BW) תמיסת גלוקוז מיקרוליטר (לדוגמה, אם העכבר שוקל 30 גרם, כמות תמיסת הגלוקוז שתינתן תהיה 300 מיקרוליטר). הפעל את הטיימר מיד לאחר מתן גלוקוז דרך הפה.
- חזור על הליך מדידת הסוכר ב-15, 30, 60, 90 ו-120 דקות.
- לאחר שכל קריאות רמת הגלוקוז נרשמו, השליכו את סכיני הגילוח ושבבי הגלוקוז למיכל ביולוגי. החזירו את המזון לכלובי העכברים והחזירו אותם לחדר החיות.
טבלה 1. לוח זמנים לרישום בדיקת סבילות לגלוקוז דרך הפה (OGTT)
| # | מזהה עכבר | גוף | גלוקוז | התחלה | 0 | 15 | 30 | 60 | 90 |
| | משקל | μL =10xBW | זמן | דקות | דקות | דקות | דקות | דקות |
| 1 | 501 | 25.8g | 258 | 9:00 | 9:00 | 9:00 | 9:15 | 9:30 | 10:00 |
| 2 | 502 | 25.3g | 253 | 9:07 | 9:07 | 9:07 | 9:22 | 9:37 | 10:07 |
