אימונוהיסטוכימיה של קטעי רקמת מוח של עכבר למיקוד נוירונים של דופמין

תקציר

מקור: Kummari, E., et. al., לכידת לייזר מיקרו-דיסקציה - הדגמה של בידוד של נוירונים בודדים של דופמין וכל האזור הטגמנטלי הגחוני., J. Vis. Exp. (2015)

בסרטון זה, אנו מדגימים את פרוטוקול האימונוהיסטוכימיה עבור נוירונים של דופמין בקטעי רקמת המוח עבור מיקרודיסקציה של לכידת לייזר לאחר מכן.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבחינת אתיקה של בעלי חיים.

1. הכנת שקופיות ורקמות

1. השתמש בשקופיות הכנה לסילאן או בשקופיות זכוכית ממברנה מפוליאתילן נפתלט (PEN).
2. לבידוד RNA, טבלו שקופיות בתמיסת טיהור RNase, שטפו 3 פעמים במים נטולי RNase ואז יבשו עם סדרה מדורגת של אתנול נטול RNase וייבשו בוואקום למשך 30 דקות.
3. חותכים קטעי רקמה בעובי של 10 מיקרומטר באמצעות קריוסטט והרכבה על השקופיות המוכנות ללא RNase. שמור את החלקים קפואים במהלך החיתוך כדי לשמור על איכות ה-RNA. הערה: ודא שהרקמה נמצאת במרחק של כ-4 מ"מ מקצוות השקופית מכיוון שה-LCM אינו יכול להסיר רקמה קרובה מדי לקצוות השקופית. על מנת להסיר רקמה ממגלשת ממברנת PEN, יש לוודא שהרקמה נמצאת 4 מ"מ משמאל, למעלה ולמטה ו-7 מ"מ מהצד הימני של המגלשה שהם מידות הממברנה שאינה מחוברת לשקופית.
4. לבידוד של אוכלוסיות תאים בודדות באמצעות אימונוהיסטוכימיה ישירה, חתכו רקמה לשקופיות ההכנה של סילאן או לשקופיות קרום PEN. לבידוד אזורי רקמה באמצעות טכניקות מונחות אימונוהיסטוכימיה עקיפה, הרכיב קבוצה אחת של חלקים על שקופית הכנה של סילאן לאימונוהיסטוכימיה וקטעים חלופיים על שקופית ממברנת PEN ו/או שקופית הכנה של סילאן לשימוש עבור LCM.

2. הכנת רקמות ללכידת לייזר - אימונוהיסטוכימיה מהירה של טירוזין הידרוקסילאז ללכידת לייזר ישירה של תאים אימונו-ריאקטיביים

1. מתאר רקמה עם עט הידרופובי ואפשר להתייבש.
2. קיבוע רקמה בתמיסת אצטון-מתנול (1:1) בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הערה: הניסיון שלנו הראה שקיבוע האצטון-מתנול הביא לאימונוהיסטוכימיה הרבה יותר עקבית מאשר אצטון או מתנול בלבד.
3. יש לשטוף את השקופית בתמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS) עם 1% טריטון (ללא RNase).
4. כסו חלקים עם 100-200 מיקרוליטר PBS עם 1% טריטון עם נוגדן טירוזין הידרוקסילאז מדולל 1:100 עם 400 U/ml RNasin. דגירה למשך 5-10 דקות.
5. יש לשטוף לזמן קצר ב-PBS פעמיים וב-PBS-1% Triton.
6. כסו רקמה עם 100-200 מיקרוליטר של IgG נגד ארנב עזים עם Alexa Fluor 488 מדולל 1:100 ב-PBS-1% טריטון עם 400 U/ml RNasin ו-50 ננוגרם/מ"ל DAPI. דגירה למשך 5 דקות.
7. יש לשטוף פעמיים ב-PBS ואז לייבש 30 שניות בסדרה מדורגת של אתנול נטול RNase (75%-75%-95%-95%-100%-100%).
8. יש לדגור בשתי שטיפות של קסילן למשך דקה אחת ואז 5 דקות.
9. הסר שקופיות מקסילן מיד לפני השימוש ב-LCM והניח לייבוש באוויר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Silane prep-slides	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S4651
95% Ethanol-RNase Free	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	E7148
100% Ethanol-RNase Free	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	E7023
Rnase Free Triton	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T8787
נוגדן אנטי-טירוזין הידרוקסיאז	EDM Millipore, Billerica, MA	Ab152
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG	Life Technologies, גרנד איילנד, ניו יורק	A-11008
RNaseZap	Life Technologies, גרנד איילנד, ניו יורק	AM9780

{{}}{{{}}{