חקר סחר בחלבוני ממברנה בתאי קולטני אור של דרוזופילה

תקציר

מקור: Wagner, K. et al., חקר סחר בחלבוני ממברנה בתאי קולטני אור של דרוזופילה באמצעות חלבונים מתויגים eGFP. J. Vis. Exp. (2022).

סרטון זה מדגים את ההדמיה של סחר בחלבון ממברנה בתאי קולטני אור של דרוזופילה באמצעות חלבוני TRPL מתויגים eGFP. הוא מפרט את הכנת הזבובים הטרנסגניים להדמיה, לכידת תמונות פלואורסצנטיות של תאים קולטני אור וכימות סחר TRPL על ידי מדידת פלואורסצנטיות eGFP יחסית ברבדומרים.

פרוטוקול

1. שיקולים כלליים

1. השתמש במניות Drosophila המבטאות חלבונים טרנסלוקציה הממוקמים באופן קבוע ברבדומר לצורך ניתוחים לגבי סחר בחלבונים (למשל, ערוץ יונים דמוי פוטנציאל קולטן חולף (TRPL):: חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (eGFP), Arrestin 2 (Arr2)::eGFP).
2. קבעו מראש את תנאי החשיפה לאור של זבובים נבחרים עבור הגישה הניסיונית.
   1. להסתגלות לחושך, שמור את הזבובים בקופסאות חשוכות לתקופה הרצויה ב-25 מעלות צלזיוס. להארה של עד 16 שעות בניסויי טרנסלוקציה (למשל, TRPL::eGFP המבטא זבובים), שמור זבובים מתחת לצינור פלואורסצנטי בטמפרטורת החדר.
   2. להארת זבובים באור צבעוני, השתמש בקופסאות פלסטיק שקופות בצבעים שונים יחד עם צינור הפלורסנט.

2. מיקרוסקופ טבילה במים

1. } הכנת זבובים
   1. הכינו את מרחב העבודה עם הציוד והריאגנטים הדרושים, כפי שמוצג ב- איור 1. העבירו זבובים עם גיל ותנאי תאורה שנקבעו מראש לתוך צינור צנטריפוגה מקורר מראש של 15 מ"ל והרדימו על ידי דגירה על קרח למשך 15 עד 30 דקות.
      הערה: קחו איתכם זבובים בני יום אחד, מותאמים לחושך כהה כהה כהה. בדרך כלל, יש להעביר זבובים מותאמים לחושך לקופסת קרח עם מכסה בחושך. ניתן להעביר זבובים מותאמים לאור לקרח באור החדר.
   2. העבירו זבוב אחד מורדם קרח עם הראש לקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר ודחפו את הזבוב לכיוון הקצה בזהירות עם אוויר דחוס.
   3. חותכים את קצה הפיפטה ממש מול הראש בעזרת אזמל. בעזרת פינצטה, דחף בזהירות את הזבוב כמה מילימטרים מהקצה. חותכים שוב את קצה הפיפטה ודוחפים את הזבוב לאחור לכיוון הקצה עם אוויר דחוס כך שרק ראש הזבוב יבלוט מקצה הפיפטה.
   4. הדביקו חתיכת פלסטלינה על מגלשת חפץ ולחצו לתוכה את קצה הפיפטה כך שהעין השמאלית או הימנית של הזבוב פונה כלפי מעלה (איור 2A). ממש לפני רכישת התמונה, השתמשו בפיפטה במעבדה כדי להדביק טיפה גדולה של מים צוננים לחלק התחתון של מטרת טבילה במים (איור 2B). המשך מיד לרכישת תמונות לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
      הערה: עיכוב משמעותי ברכישת התמונה גורם להתעוררות מחדש ולתנועות של הזבוב שעלולות להוביל לתמונות מטושטשות.
      
2. 1. הנח בזהירות את שקופית האובייקט עם הזבוב המוכן על במת המיקרוסקופ ובחר יעד טבילה במים.
   2. הנמיכו את מטרת הטבילה במים באופן ידני עד שעין הזבוב נוגעת בטיפה (איור 3A, B).
   3. הפעל את מנורת המיקרוסקופ UV ובחר את ערכת המסננים המתאימה. השתמש בעיניות כדי למקם את הזבוב מתחת למטרה ולמקד את המיקרוסקופ על פני העין.
   4. העבר את נתיב האור לכיוון מצלמת המיקרוסקופ וצור תמונה חיה בתוכנה המתאימה. התאם מחדש את המיקוד עבור המצלמה והעריך את כיוון העין, בהתחשב בכך שהעין צריכה לפנות לאובייקט המיקרוסקופ בצורה רדיאלית, כפי שמוצג בפירוט רב יותר באיור 3C-E.
   5. השתמש ב-LUT (טבלת חיפוש) המתאימה בתוכנת ההדמיה כדי לזהות רוויית יתר (מסומנת כפיקסלים אדומים).
   6. במקרה של זבובים ללא פיגמנט, התאם את זמן החשיפה כך שהפיקסלים הבהירים ביותר יהיו ממש מתחת למגבלת הרוויה עבור כל תמונה.
   7. הקלט תמונה ושמור אותה כקובץ גולמי כדי לאחסן בארכיון את כל המטא נתונים המתאימים של ההקלטה. ייצא את התמונה בתבנית .tif לכימות הבא.
      הערה: האירו את הזבובים במשך 5 דקות באור אדום (למשל, 630 ננומטר) מיד לאחר רכישת התמונה, אם הם מיועדים לשמש לניסויים נוספים. אור אדום מבטל את מפל הפוטו-טרנסדוקציה שהופעל יתר על המידה על ידי אור אינטנסיבי עם גלים קצרים במהלך רכישת התמונה.
      
3. ניתוח נתונים וכימות של פלואורסצנטיות eGFP יחסית ברבדומרים של מיקרוגרפים טבולים במים
   1. } הורדה, התקנה והפעלה של התוכנה ImageJ/Fiji.
   2. התאם את הגדרות ImageJ על ידי לחיצה על Analyze > Set Measurements... ולסמן רק את התיבה עבור ערך אפור ממוצע. ייבא תמונה .tif על ידי לחיצה על קובץ > לפתוח... או על ידי גרירה ושחרור. בחר אזור מייצג של התמונה שנמצא במוקד והגדל אותו ל-200%-300% על ידי לחיצה חוזרת ונשנית על Ctrl ו-+ יחד.
   3. בחר בכלי Oval ותוך כדי לחיצה על מקש Shift , צור בחירה מעגלית בתמונה שהיא קטנה משמעותית מרבדומר פלואורסצנטי אחד. לפני שחרור לחצן העכבר, חפש את הגודל המדויק המוצג מתחת לסרגל הכלים בחלון הראשי של ImageJ. השתמש באותו גודל של בחירה מעגלית עבור כל הניתוחים.
      הערה: הגודל המדויק של הבחירה המעגלית בפיקסלים או מיקרונים תלוי בהגדרה הספציפית. השתמש במעגל בערך 1/3 או 1/4 מקוטר הרבדומרלי של זבובי ביקורת בני יום אחד, מותאמים לחושך.
   4. הזז את הבחירה המעגלית על-ידי לחיצה עם העכבר לתוכה וגרירה או על-ידי הקשה על מקשי החצים בלוח המקשים.
   5. כדי למדוד את עוצמות הקרינה בתוך הבחירה המעגלית, הזיזו את העיגול לרבדומר הראשון (r1) ולחצו על Analyze > Measure או השתמשו בקיצור הדרך Ctrl + M. יופיע חלון תוצאה המפרט את הערך האפור הנמדד.
   6. המשך במדידות של r2-r6 כמדידות חוזרות ומדידה של אות הרקע (b). במקרה של זבובים ללא פיגמנט, בצעו מדידות נוספות של אזורי גוף התא המתאימים (c1-c6) (איור 4).
   7. חזור על שלבים 2.3.5 ו-2.3.6 עבור שתי אומטידיות נוספות, וכתוצאה מכך שלושה שכפולים טכניים. סמן את האומטידיה המנותחת באמצעות כלי העיפרון ושמור תמונה זו לתיעוד.
   8. בחר והעתק את ערכי האפור הנמדדים מחלון התוצאה והדבק אותם בתוכנת גיליון אלקטרוני לצורך חישובים נוספים. מיין את ערכי עוצמת הקרינה לפי מקורם לקטגוריות רבדומר (r), גוף התא (c) ורקע (b). חשב את העוצמה הממוצעת מכל קטגוריה (Ir, Ic, Ib).
   9. חשב את הכמות היחסית של eGFP הקיימת ברבדומר.
   10. המשך עם התמונה הבאה בשלב 2.3.3. מומלץ להשתמש בתמונות של לפחות חמישה אנשים מכל קבוצת ניסוי כשכפולים ביולוגיים כדי לקבל מדידה אמינה.

תוצאות

איור 1: סביבת עבודה של מיקרוסקופ טבילה במים. החומרים הדרושים הם: (A) צינור צנטריפוגה 15 מ"ל, (B) פתיתי קרח, (C) מים מזוקקים צוננים, (D) סטריאומיקרוסקופ, (E) צ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
15 mL צינור צנטריפוגה	Greiner Bio-One	188271
כרית זבוב להרדמת פחמן דו חמצני	Flystuff	59-172
מנורת אור קר (KL 1500 LCD)	Zeiss
Fiji/ImageJ	NIH
מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מנורת UV, מצלמה, ערכת מסננים ותוכנה (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue edition)<
צינור פלואורסצנטי	Osram	4050300518039.00<
פיפטה מעבדה (20-200 μL)	Eppendorf
Object slide	Roth	656.1
קצות פיפטה (200 μL)<	7695844
Plasticine (Blu-Tack)	Bostik	30811745
Stereo microscope (SMZ445)	Nikon
מיקרוסקופ סטריאו עם מנורת UV, מצלמה, ערכת תיוק ותוכנה (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12)	Leica

td style='border-left-style:none;border-top-style:none;'>Zeisstd style='border-left-style:none;border-top-style:none;'> td style='border-left-style:none;border-top-style:none;'>Labsolute