איתור שינויים בהיסטון בתאי שמרים עם ביטוי יתר של חלבון ניווני

תקציר

מקור: Bennett, S. A., et al., אפיון שינויים בשינוי פוסט-תרגומי של היסטון במודלים של חלבונים ניווניים של שמרים. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים את ההליך של הערכת שינויים בהיסטון בתאי שמרים המבטאים יתר על המידה חלבונים ניווניים. השלבים כוללים ליזיס תאים, צנטריפוגה, אלקטרופורזה, העברת ממברנה וזיהוי מבוסס נוגדנים של היסטונים ששונו.

פרוטוקול

1. ליזיס תאים וכתמים מערביים לאיתור שינויים לאחר תרגום היסטון

1. }ליזיס תאים
   1. להפשיר כדורי תאי שמרים על קרח ולהשעות מחדש כדורי תאים ב-100 מיקרוליטר של dH₂O.
   2. למתלה מחדש של התא, הוסף 300 מיקרוליטר של 0.2 M NaOH ו-20 מיקרוליטר של 2-מרקפטואתנול. השעיה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
   3. דגירה של תאים על קרח למשך 10 דקות ולאחר מכן צנטריפוגה ב-3,200 x g על צנטריפוגה שולחנית למשך 30 שניות ב-RT. השליכו סופרנטנט.
   4. השעו מחדש את גלולת התא ב-100 מיקרוליטר של צבע טעינה 1x והרתיחו במשך 10 דקות על בלוק חימום.
      הערה: את המתכון לטעינת צבע פי 6 ניתן למצוא בטבלת החומרים.
2. אלקטרופורזה של ג'ל נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד והעברת ממברנה
   1. הכן את תא הג'ל על ידי הנחת שני ג'לים במחזיק ג'ל, מילוי החדר הפנימי למעלה עם מאגר רץ ומילוי התא החיצוני עד לסימון קו שני הג'ל.
   2. טען 15 מיקרוליטר של דגימה לבאר לתוך ג'ל פוליאקרילאמיד של 10 בארות 12%. עבור נתיב סולם החלבון, טען 5 מיקרוליטר.
   3. הפעל את הג'ל במשך כ-45 דקות ב-150 וולט, או עד שחזית צבע הטעינה מגיעה לתחתית הג'ל.
   4. בזמן שהג'ל פועל, התכוננו להעברת הממברנה על ידי השריית רפידות סיבים (שתיים לכל ג'ל) במאגר העברה ( טבלת חומרים) והשריית ממברנת פוליווינילידן פלואוריד (PVDF) במתנול. שטפו את הממברנה במאגר ההעברה לפני ההעברה.
      הערה: יש לחתוך את קרום ה-PVDF לגודל הג'ל ולהשתמש בקרום PVDF אחד לכל ג'ל שמועבר.
   5. הרכיבו, על תא מכשיר העברה יבש למחצה, 'כריך' העברה: מהאלקטרודה התחתונה, הניחו (1) כרית סיבים ספוגה מראש, (2) קרום PVDF ספוג ושטופ, (3) ג'ל, ו-(4) כרית סיבים שנייה ספוגה מראש.
      הערה: כדי למנוע בועות אוויר ב'כריך' ההעברה, ' גלגל בעדינות את ה'כריך' עם פיפט סרולוגי כדי להוציא בועות. לאחר הנחת הג'ל על גבי קרום ה-PDVF, אל תזיז אותו.
   6. כדי לבצע העברת חלבון, הגדר את חבילת הכוח ל-150 mA למשך שעה אחת (עבור 'כריך' אחד').
3. איתור שינויים פוסט-תרגומיים של היסטון (PTMs) עם נוגדנים ספציפיים לשינוי
   1. הסר את הממברנה ממנגנון ההעברה. יש לשטוף לזמן קצר עם dH₂O.
      1. לחלופין, לבדוק את העברת החלבונים עם כתם Ponceau-S על ידי יציקת מספיק כתם Ponceau-S כדי לכסות את הממברנה בקופסת פלסטיק קטנה ודגירה ב-RT עם ניעור עדין למשך 30-60 שניות. יש להסיר את כתם Ponceau-S ולשטוף עם dH₂O עד שכתם הרקע נעלם ורצועות החלבון נראות לעין בלתי מזוינת. המשיכו לשטוף עם dH₂O עד שכל הכתם יוסר מהממברנה.
   2. חסום את הממברנה על ידי דגירה של הכתם למשך שעה אחת ב-RT עם נדנוד עדין במאגר חוסם תמיסת מלח (TBS) ( טבלת חומרים) בקופסת צביעה קטנה. השתמש במספיק מאגר חוסם כדי לכסות את הכתם.
      הערה: הקפד למקם את הממברנה זקופה בקופסת הצביעה כך שצד הממברנה שעליו מונחים החלבונים לא יפנה כלפי מטה.
   3. דגרו כתם בקופסת הצביעה למשך הלילה עם נוגדן ספציפי לשינוי היסטון המגיב כלפי שמרים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. כלול גם בקרת העמסה גרעינית מתאימה, כגון אנטי-טוטאל H3 שגדל במין מארח שונה מהנוגדן הספציפי לשינוי. לדוגמה, אם מחפשים H3S10ph עם נוגדן נגד H3S10ph שגדל בארנבות, השתמש בנוגדנים נגד H3 שגדלו בעכברים כבקרת העמסה. חזור על פעולה זו עבור כל כתם לפי הצורך.
      הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר בדילול נוגדנים בסך הכל שלוש פעמים בתוך חודש. אחסנו אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   4. שטפו את הממברנה 4x ב-TBS תוצרת בית + 0.1% פוליסורבט 20 (TBST) למשך 5 דקות עם נדנוד ב-RT.
   5. כתם דגירה עם נוגדנים משניים פלואורסצנטיים בדילולים שצוינו על ידי היצרן (חמור נגד ארנב 680 ונגד עכבר חמור) למשך שעה אחת ב-RT.
      הערה: יש להגן על נוגדנים משניים פלואורסצנטיים מפני אור הן במהלך האחסון והן במהלך השימוש. בצע דגירה בקופסאות פלסטיק כהות או מכסים בנייר אלומיניום.
   6. שטפו את הממברנה 4x עם TBST למשך 5 דקות ושטפו עם TBS למשך 5 דקות תוך כדי נדנוד ב-RT.
   7. דמיינו כתם במערכת הדמיית כתמים מערביים פלואורסצנטיים למשך 2 דקות. דמיין את הנוגדנים המשניים נגד ארנב 680 ונגד עכבר 800 בערוצים 800 ננומטר ו-700 ננומטר, בהתאמה.
      הערה: שכפולים מתבצעים באופן עצמאי החל מסעיף 1. לפירוש נתונים מתאים בניסויים אלה, יש לוודא שתגובת אות הנוגדן נמצאת בטווח שבו תגובת האות היא ליניארית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
10x Running Buffer			תערובת: 141.65 גרם גליצין (ThermoFisher BP381-1), 30.3 גרם בסיס טיזמה (Sigma-Aldrich T6066), 10 גרם נתרן דודציל סולפט (Sigma-Aldrich L3771), ו-1 ליטר מים נטולי יונים, pH 8.8.
12% ג'ל פוליאקרילאמיד	BIO-RAD	456-1041
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) ראשוני Antibody	MilliporeSigma	07-353 (פריט מס' 2762291)	דילול: 1/1000
Anti-acetyl-Histone H4 (Lys16) Primary Anti-	Abcam	ab109463 (פריט מס' GR187780)<
Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody	Abcam	ab46983 (פריט מס' GR71882)	דילול: 1/5000
Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary Antibody	Abcam	ab9049 (פריט מס' GR266894, GR3236147)<
Anti-Histone H3 Primary Antibody	Abcam	ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335)<
Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary Antibody	Abcam	ab188292 (פריט מס'. GR211874)	דילול: 1/1000
Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody	Abcam	ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296)<
BioPhotometer D30	Eppendorf	6133000010
צנטריפוגה 5804/5804 R/5810/5810 R	Eppendorf	22625501
Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW	LI-COR	926-32212 (פריט מס' C60301-05, C61116-02, C80108-05)	דילול: 1/5000
Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD	LI-COR	926-68073 (פריט מס' C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07)	דילול: 1/2500
אתנול	Sigma-Aldrich	E7023
נייר כתמים עבה במיוחד (נייר פילטר)	BIO-RAD	1703968
ממברנות העברת אימובילון-FL<	IPFL00010
Loading Dye			תערובת: 1.2 גרם נתרן דודציל סולפט, 6 מ"ג ברומופנול כחול (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 מ"ל גליצרול, 1.2 מ"ל 0.5M בסיס טריזמה pH 6.8, 0.93 גרם DL-Dithiothreitol ( Sigma-Aldrich D0632), ו-2.1 מ"ל מים נטולי יונים.
מתנול	ThermoFisher	A412-4
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell	BIO-RAD	1658004
צינור רב-ערוצי	Eppendorf	2231300045
Nuclease Free Water	Qiagen	129114
Odyssey Fc Imaging System	LI-COR Biosciences	2800-03
pAG303GAL-a-synuclein-GFP	מתנה מא. גיטלר
pAG303GAL-ccdB	Addgene	14133
pAG303Gal-FUS	Addgene	29614
pAG303GAL-TDP-43	מתנה מאת A. Gitler	<
Poly(ethylene glycol) (PEG)	Sigma-Aldrich	P4338	הכן פתרון של 50% w/v.
Ponceau S Stain	Sigma-Aldrich	P3504	ערבב: 0.5 גרם 0.1% w/w צבע Ponceau S, 5 מ"ל 1% v/v חומצה אצטית (Sigma-Aldrich 320099), ו-500 מ"ל מים נטולי יונים.
ספק כוח בסיסי של PowerPac	BIO-RAD	164-5050
נתרן דודציל סולפט מאגר טעינה			אחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. 6X, תערובת: 1.2 גרם נתרן דודציל סולפט, 6 מ"ג ברומופנול כחול, 0.93 גרם DL-דיתיותרייטול, 2.1 מ"ל מים נטולי יונים, 4.7 מ"ל גליצרול ו-1.2 מ"ל 0.5 מ"ל בסיס טריזמה, pH 6.8.
נתרן הידרוקסיד	Sigma-Aldrich	221465	הכן תמיסה של 0.2 מ'.
TBS + 0.1% Tween 20 (TBST)			ערבוב: 100 מ"ל 10X TBS, 1 מ"ל Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), ו-900 מ"ל מים נטולי יונים.
TBS חסימת מאגר	LI-COR	927-5000
Trans-Blot SD חצי יבש תא העברה אלקטרופורטי	BIO-RAD	170-3940
העברה Buffer			תערובת: 22.5 גרם גליצין, 4.84 גרם בסיס טיזמה, 400 מ"ל מתנול, 1 גרם נתרן דודציל סולפט ו-1.6 ליטר מים נטולי יונים.
Tris-Buffered Saline (TBS)			10X, 7.6 pH, פתרון: מערבבים 24 גרם בסיס Trizma, ו-88 גרם נתרן כלורי (Sigma-Aldrich S7653). ממלאים עד 1 ליטר במים נטולי יונים.
WT 303 S. cerevisiae yeast	מתנה מ-J. Shorter

td style='width:314pt;'>דילול: 1/2000td style='width:314pt;'>דילול: 1/1000td style='width:314pt;'>בקרת טעינה גרעינית; דילול: 1/2000td style='width:' 314pt;'>דילול: 1/1000td style='width:' 108pt;'>MilliporeSigmatd style='width:314pt;'> יבש