$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. יצירת ספרואידים גידוליים בגודל אחיד
הערה: תאים דמויי גזע מתורבתים בתווך נוירו-בסיסי בתוספת תוסף B27, הפרין, גורם גדילה פיברובלסטים 2 (FGF-2), פניצילין וסטרפטומיצין. תאים אלה יוצרים באופן ספונטני ספרואידים בתרבית.
- שטפו את תאי הגידול בתמיסת מלח עם 5 מ"ל פוספט (PBS) ודגרו את התאים עם אנזים דיסוציאציה של 0.5-1 מ"ל למשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
- שטפו עם 4-4.5 מ"ל PBS והוסיפו 10 מ"ל ממצע הגידול השלם (מדיום נוירו-בסיסי מלא, cNBM).
- ספור את התאים באמצעות טכניקת ספירה אוטומטית עם טריפן כחול ושקופית תא ספירת תאים.
- כדי ליצור 100 ספרואידים עם 104 תאים לכל ספרואיד (לפי הגודל המועדף), ערבבו 106 תאים ב-8 מ"ל של NBM עם 2 מ"ל של 2% מתיל צלולוז.
- העבירו את המתלה למיכל מערכת סטרילי והוציאו 100 מיקרוליטר / באר עם פיפטה רב ערוצית לצלחת תחתונה עגולה של 96 בארות.
- דגרו את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ו-95% לחות. ייווצרו ספרואידים בגודל שווה וניתן להשתמש בהם לאחר 3-4 ימים.
2. ניסויים תלת מימדיים
- } פלישה
- הכנת מטריצת הקולגן בשפופרת על קרח עם קולגן מסוג I בריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל, 1x PBS, 0.023xVקולגן, 1 M נתרן הידרוקסיד, ו-H סטרילי2O. דגרו את התמיסה על קרח למשך 30 דקות.
- אספו ספרואידים מצלחת הבאר התחתונה העגולה בצינורות של 500 מיקרוליטר ושטפו פעמיים עם 200 מיקרוליטר 1x PBS.
- פיפטו את הכדורים בזהירות לתוך 100 מיקרוליטר של מטריצת הקולגן והכניסו למרכז באר בצלחות רגילות של 96 בארות.
- דגרו את ג'ל הקולגן למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן הוסיפו cNBM על גבי הג'ל. מעכבים או מפעילים (למשל, מימן כלורי כפי שמוצג ב-איור 1B, 1C) יכולים להיות מתווספים למדיום בשלב זה.
- רכישת תמונות וניתוחן
- צלם תמונות ברצף עם מיקרוסקופ וידאו במצב שדה בהיר 24 שעות לאחר הכללת קולגן.
- השתמש בפיג'י כדי לנתח תמונות באופן ידני או אוטומטי למחצה. כדי לעשות זאת באופן ידני, צייר סביב הליבה והשטח הכולל של הספרואיד עם כלי הבחירה ביד חופשית ומדוד את האזור הפולשני של כל ספרואיד על ידי הפחתת השטח הכולל עם שטח הליבה. כדי לנתח את התמונות בצורה חצי אוטומטית, השתמש במאקרו כדי לקבוע את האזור הפולשני.
