איתור חלבון הקשור למחלות נוירודגנרטיביות α-Synuclein באמצעות ELISA

תקציר

מקור: Bétemps, D., et al., זיהוי α-synuclein הקשור למחלה על ידי ELISA משופר במוחם של עכברים טרנסגניים המבטאים יתר על המידה A53T אנושי מוטציה α-synuclein. J. Vis. Exp. (2015).

סרטון זה מדגים את ההליך לאיתור חלבון α-synuclein הקשור למחלות נוירודגנרטיביות ברקמת המוח מעכברים טרנסגניים באמצעות ELISA. השלבים כוללים הומוגניזציה של רקמות, צנטריפוגה וזיהוי ELISA של חלבון α-synuclein כדי לכמת את צורותיו הקשורות למחלה.

פרוטוקול

כל ההליכים הקשורים לדגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לביקורת אתית של בעלי חיים.

1. מיצוי α-synuclein (αS) מאזורי מוח מנותחים

1. } לנתח מוח שלם בצלחת פטרי מפלסטיק 35 מ"מ על קרח עם זכוכית מגדלת בעוצמה נמוכה (הגדלה פי 8) באמצעות שני חורצים שקצותיהם נשמרים יחד למעט בעת ניתוח ההיפוקמפוס. אין לחרוג מ-10 דקות כדי לשמור על שלמות המוח. מקמו את המוח בצד ימין כלפי מעלה ואחזרו את אזורי המוח הבאים בסדר הזה:
   1. הפרד אחת משתי פקעות הריח באמצעות מלקחיים שממוקמים ממש מאחוריה. נתק אותו מהמוח על ידי הזזתו כלפי מטה. חזור על פעולה זו עבור הנורה השנייה.
   2. תקעו בעדינות את המלקחיים בין שתי קליפות המוח והזיזו אותם קדימה כדי להקל על דיסוציאציה של שתי קליפות המוח. שמירה על המוח במקומו עם מלקחיים אחד, השתמשו במלקחיים אחרים כדי להפריד את קליפת המוח מההיפוקמפוס.
   3. מקם את המלקחיים 2 מ"מ מתחת לקליפת המוח. שמור על לחץ עדין על המלקחיים עד שהחלק העליון של ההיפוקמפוס נראה לעין. מקלפים את החלק הראשון של קליפת המוח, וחוזרים על הפעולה עם החלק השני. השתמשו במלקחיים כדי להפריד בין שתי קליפות המוח, החל מההיפוקמפוס ועד לכיוון החלק הקדמי של המוח.
   4. מקם את המלקחיים הפתוחים סביב אחד ההיפוקמפוס. סגור את המלקחיים בתחתית ההיפוקמפוס ואז הסר אותו בעדינות, התאושש ככל האפשר. חזור על ההליך עבור ההיפוקמפוס השני.
   5. מקם את המלקחיים הפתוחים מתחת לאחד הסטריאטות והפריד אותו בעדינות מהמוח. השתמש במלקחיים כדי להסיר את כל הקורטקס שנותר מהסטריאטום. חזור על הליך זה עבור הסטריאטום השני.
   6. השתמש במלקחיים כדי ללחוץ בעדינות את קווי המתאר של המוח הקטן ב -2 מ"מ כדי להקל על הפרדתו מהמוח. הנח את המלקחיים ממש מאחורי המוח הקטן והסר אותם על ידי הזזת המלקחיים קדימה.
   7. השתמש בחלק הרחב של המלקחיים כדי להרים את המזנספלון על מנת לראות בבירור היכן הוא מצטרף לגזע המוח. בצע חתך אנכי בצומת ואז הסר את גזע המוח.
   8. מקם את המלקחיים מאחורי המזנספלון, המורכב מארבעה מבנים מעוגלים. חותכים אנכית עד שהמזנספלון מופרד לחלוטין מהמוח שנותר.
2. הכינו הומוגנטים באחוזים משתנים (משקל/נפח) במאגר גבוה של מלח (HS), בהתאם למספר הרקמות הזמינות: 5% הומוגנט למשקל שבין 10 ל-30 מ"ג, 10% למשקל שבין 30 ל-80 מ"ג, ו-20% למשקל מעל 80 מ"ג.
   1. הוסף נפח מספיק של מאגר HS לאזורי המוח המנותחים כדי לקבל את האחוז הצפוי של הומוגנט.
   2. מערבולת ובדוק שהרקמות שקועות במלואן במאגר HS.
   3. הומוגניזציה של דגימות שהוכנו מאזורי המוח המנותחים או מחוט השדרה הצווארי באמצעות מטחנת רקמות המורכבת מצינור זכוכית בורוסיליקט ושני עליים, A ו-B.
   4. } שפכו כל אזור במוח כדי להימחץ ישירות לתוך הצינורית. הכנס עלי A לתוך הצינור ומשוך אותו. חזור על תנועה זו כעשר פעמים כדי לנתק את הרקמה. לאחר מכן השתמש בעלי B כדי להמשיך לטחון את הרקמה ב-20 תנועות נוספות. מעבירים את ההומוגנטים לשפופרת של 1.5 מ"ל עם פיפטת העברה של 1 מ"ל.
3. צנטריפוגה את הדגימות ב-1,000 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לחסל כל שברי מוח לא מקורקעים. אחזר את הסופרנטנטים, חלק אותם ל-200 מיקרוליטר אליקוטים, ושמור אותם בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לניתוח שלאחר מכן.

1. זיהוי αS על ידי ELISA

1. לדלל את נוגדני הציפוי ל-0.01 ננוגרם/מ"ל. השתמש בנוגדנים אנטי-αS רב-שבטיים או חד-שבטיים 42 במאגר 50 מ"מ Na₂CO₃/NaHCO₃ (pH 9.6).
2. מצפים את המיקרו-לוחות של 96 בארות ב-100 מיקרוליטר לבאר של תמיסת ציפוי זו, ומשאירים ב-4 מעלות צלזיוס O/N. השתמש בנוגדנים הפוליקלונליים של ארנב אנטי-αS בתמיסת הציפוי עבור ELISAs באמצעות נוגדנים לזיהוי syn514, שיבוט 42, LB509, AS11, 4D6 או 8A5. השתמש בנוגדנים חד-שבטיים נגד αS שיבוט 42 כתמיסת ציפוי בשילוב עם נוגדן הזיהוי anti-pSer129 αS.
   הערה: במידת הצורך, ניתן לשמור את הלוחות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע לפני ביצוע ה-ELISA.
3. השתמש במכונת כביסה כדי לשטוף את הצלחות חמש פעמים עם 300 מיקרוליטר של מי מלח עם חוצץ פוספט עם 0.05% טווין 20 (PBST) לבאר. משלב זה ואילך, הדגירה היא ב-RT.
4. הוסף 200 מיקרוליטר של T20 PBS (מי מלח עם חוצץ פוספט) לכל באר. יש לנער במשך שעה אחת ב-150 סל"ד. שוטפים את הצלחות חמש פעמים עם PBST.
5. לדלל את המוח ההומוגנטי (דילול של 1:100 של 20% הומוגנטים, 1:50 מתוך 10% הומוגנטים ו-1:25 מתוך 5% הומוגנטים ב-PBST BSA 1%), ולהוסיף 100 מיקרוליטר לכל באר. לאחר מכן יש לדגור למשך שעתיים תוך כדי טלטול במהירות של 150 סל"ד. שוטפים את הצלחות חמש פעמים עם PBST.
6. הוסף את הנוגדנים השונים לזיהוי αS ב-PBST עם אלבומין בסרום בקר (BSA) 1% בדילולים המוזכרים ברשימת החומרים. דגירה למשך שעה ב -150 סל"ד. שוטפים את הצלחות חמש פעמים עם PBST.
7. הוסף מצומדים IgG HRP נגד עכבר או נגד ארנב מדולל 1:8,000 ב-PBST בתוספת BSA 1% למשך שעה אחת תוך ניעור ב-150 סל"ד. שוטפים את הצלחות חמש פעמים עם PBST.
8. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) לכל באר ודגר במשך 15 דקות בחושך תוך כדי ניעור ב-150 סל"ד.
9. עצור את התגובה על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של 1 N HCl לבאר ולאחר מכן מדוד את הספיגה ב-450 ננומטר עם קורא המיקרו-פלטות.
10. לניתוח נתונים, הפחיתו את ערך ה-OD שהתקבל בבאר עם כל הריאגנטים למעט דגימות מוח של עכבר (באר ריקה) מערכי ה-OD שנמדדו עבור כל אחת מהדגימות שנותחו.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
LB509		Abcam	ab27766	נוגדן זיהוי 1/2000
AS11		מיוצר ב-Anses		זיהוי נוגדן 1/1000
4D6		Abcam	ab1903	זיהוי נוגדן 1/2000
PSer129		Abcam	ab59264	נוגדן זיהוי 1/3000
PSer129 EP1536Y		Abcam	ab51253	נוגדן זיהוי 1/1000
Syn514		Abcam	ab24717	נוגדן זיהוי 1/500
Clone 42		BD Biosciences	610787	ציפוי וזיהוי נוגדן (1/2000)
8A5		מסופק על ידי Dr. Anderson		זיהוי נוגדן 1/2000
Polyclonal anti-alpha syn anti-sync<	Millipore	AB5038P	נוגדן ציפוי
מצומד IgG HRP נגד עכבר		Southern Biotech	1010-05
Anti-rabbit IgG HRP conjugate<	Southern Biotech	4010-05
Goat anti-mouse IgG HRP conjugate		Dianova	115-035-164
HS buffer	Tris-HCl 50 mM	Euromedex	26-128-3094-B	התאם ב-pH 7.5 ושמור על 4°C
NaCl 750 mM	Euromedex	1112-A
EDTA 5 mM	Euromedex	EU0007-B
DTT 1 mM	Sigma	43815
PBS	דיסודיום מימן פוספט1 mM	Euromedex	1309	התאם ב-pH 7.5
מונופוטסיום פוספט 1.5 mM	Euromedex	2018
NaCl 137 mM	Euromedex	1112-A
KCl 2.7 mM	Euromedex	P017
Tween 20		Euromedex	2001-C
BSA		Sigma	A7906
Microplate MaxiSorpTM		Thermo Scientific	442404
טמפון קרבונט 50 מ"מ pH 9.6	נתרן פחמתי decahydrate	Sigma	71360	2.86 g/L
נתרן ביקרבונט	Merk	6329	3.36 g/L, pH9.6
Superblock T20 PBS חסימה buffer		Pierce	E6423H	10 X concentrated
TMB		Sigma	T0440	משמש עבור ELISA
TMB		Analytik Jena AG	847-0104200302	משמש למיפוי אפיטופים
HCl 1N		Chimie plus	40030
Ribolyser		Thermo	Fast prep FP120	Keep on ice בשלב
Grinding tubes		Biorad	355-1197
מכונת כביסה של צלחות		Tecan	Columbus Pro
Plate reader		Biorad	Model 680
זכוכית מגדלת בהספק נמוך		VWR	630-1062	X8 magnification
מלקחיים Dumont#7		WPI	14097	for dissection
העברת פיפטה 1ml Samso		Samso	43231
1.5 ml tubes		Dutscher	33290

td style='width:200pt;'> td style='width:200pt;'> זה steps