מידול גרורות של גידולי מוח באמצעות הזרקת תאים סרטניים בעורק הצוואר הפנימי

תקציר

מקור: Lim, M., et al. מידול גרורות במוח על ידי הזרקת עורק הצוואר הפנימי של תאים סרטניים. J. Vis. Exp. (2022)

בסרטון זה, עכבר מורדם עובר הליך כירורגי שבו מוזרקים תאים סרטניים לעורק הצוואר המשותף (CCA) כדי להקל על העברה ממוקדת למוח. ההליך כולל תפירה מדויקת ומניפולציה של עורקי הצוואר כדי לכוון את התאים המוזרקים לעבר עורק הצוואר הפנימי (ICA), ולקדם היווצרות גידול במוח לאורך זמן.

פרוטוקול

כל ההליכים הקשורים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים וועדת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הכנת תאים סרטניים להזרקה

הערה: במחקר זה נעשה שימוש בקו תאי סרטן השד האנושי, BT-474 (BT474). BT474 תורבת במדיום גידול שלם המורכב ממדיום RPMI (Roswell Park Memorial Institute Medium) 1640 בתוספת 10% סרום בקר עוברי ו-1% אינסולין. התאים נשמרו באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני באוויר. אמת את קו התאים על ידי בדיקות חוזרות טנדם לווייניות, אשר את ביטוי החלבון המדווח (למשל, לוציפראז), אם קיים, ובדוק אם יש זיהום במיקופלזמה.

1. זרע תאי סרטן BT474 בצפיפות זריעה של 2.0 × 10^6 תאים לבקבוק T75 תוך שימוש ב-10 מ"ל של מצע גידול מלא ותרבית (ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני) עד מפגש של 70%-80% לפני ההזרקה.
2. ביום ההזרקה, השליכו את אמצעי הגידול ושטפו את שכבת התא פעמיים עם מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS).
3. הוסף 5 מ"ל של מגיב דיסוציאציה של תרבית תאים שחומם מראש ודגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות או עד שהתאים מתנתקים. לאחר 5 דקות, הקש בעדינות על הבקבוק כדי לסייע בניתוק התאים.
4. הוסף 5 מ"ל של מצע גדילה מלא המכיל 10% סרום בקר עוברי כדי להרוות את פעילות ריאגנט הדיסוציאציה.
5. השעו בעדינות את התאים על ידי פיפטינג כדי להפחית את גושי התאים.
6. העבירו את תרחיף התא לתוך צינור של 50 מ"ל וצנטריפוגה ב-180 x g למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
7. יש לשפוך את הסופרנטנט ולהשעות מחדש את גלולת התא ב-10 מ"ל של תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) ללא סידן ומגנזיום כדי למזער את היווצרות התאים.
8. צנטריפוגה של תרחיף התא בטמפרטורת החדר ב-180 x g למשך 3 דקות.
9. שפכו את הסופרנטנט כדי להסיר שאריות סרום/מגיב דיסוציאציה ולהשעות מחדש את גלולת התא ב-3 מ"ל של HBSS.
10. הניחו מסננת תאים של 100 מיקרומטר על צינור חרוטי טרי של 50 מ"ל והעבירו את תרחיף התאים כדי להסיר גושי תאים.
    הערה: תרחיף חד-תאי חיוני כדי למזער את חסימת כלי הדם ואת הסיכון לשבץ מוחי בהזרקה.
11. חשב את מספר התאים ברי קיימא באמצעות אי הכללה של טריפן בלו והמוציטומטר בשיטות סטנדרטיות.
12. לדלל את תרחיף התאים עם HBSS לריכוז תאים של 2.5 x 10⁶ תאים/מ"ל.
13. שמור את הצינור אופקי על הקרח ונדנד בעדינות את הצינור מעת לעת כדי למזער את הגושים. ניתן לאחסן את תרחיף התא על קרח למשך 6 שעות לכל היותר.
    הערה: הנדנדה נעשתה באופן ידני, אך ניתן לעשות זאת גם באמצעות שייקר בסל"ד נמוך.

2. הכנת העכבר להליך

} הערה: במחקר זה, נעשה שימוש בעכברי NOD scid נקבות בנות 4-5 שבועות. הציגו לעכברים מזון התאוששות מדיאטה רכה (למשל, ג'ל דיאט, הידרוג'ל, פירה עכבר) 3 ימים לפני ההליך כדי לעודד האכלה לאחר ההליך.

1. כלי ניתוח חיטוי. יש לרסס ולנגב את אזור הניתוח והציוד בחומר חיטוי משטחים, ואחריו 70% אתנול.
2. הנח מחצלת חום של בעלי חיים מתחת ללוח הניתוח כדי למנוע היפותרמיה. הפעל זאת 30 דקות לפני הניתוח. יש לרסס ולנגב את לוח הניתוח בחומר חיטוי משטחים, ואחריו 70% אתנול.
3. הכינו כלוב מגורים נקי לבעלי חיים וכרית חימום חמה להתאוששות.
4. לבשו ציוד מגן אישי נקי (חלוק, מסכה, רשת שיער וכפפות). שמרו על סטריליות לאורך כל ההליך באמצעות כפפות בדיקה נקיות וטכניקת 'טיפים למכשירים בלבד'.
5. להרדים את העכבר עם תא הרדמה באמצעות איזופלורן 5% עם זרימת חמצן של 2 ליטר לדקה עד שהעכבר מאבד את רפלקס הדוושה.
6. הוציאו את החיה מהתא והניחו אותה בקונוס אף המספק 2% איזופלורן בזרימת חמצן של 2 ליטר לדקה עבור ההליך הכירורגי הנותר.
7. עכבר אגרוף אוזניים לזיהוי והשתמש בקוצץ חשמלי כדי לגלח את הפרווה מאזור הצוואר. יש לנקות שיער עודף מעור חשוף באמצעות סרט דבק.
8. שקלו את העכבר לחישוב מינוני תרופות ההרדמה ומשככי הכאבים הנדרשים. יש לתת בופרנורפין ומלוקסיקם במינון של 50 מיקרוגרם/ק"ג ו-1 מ"ג/ק"ג, בהתאמה, באמצעות הזרקה תת-עורית.
9. העבירו את העכבר ללוח כירורגי חם ואבטחו את חרוט האף בעזרת סרט.
10. יש למרוח חומר סיכה לעיניים על העיניים כדי למנוע התייבשות.
11. אבטח את העכבר בעדינות על ידי חיבור השיניים החותכות העליונות באמצעות חוט המודבק ללוח הניתוח, ולאחר מכן הדבקת הרגליים הקדמיות והאחוריות. שלב זה מאריך את הגוף ושומר על הצוואר ישר במהלך ההליך.
12. בצע הכנת עור לפני הניתוח כמתואר להלן.
    1. נגב את הצוואר בחומר חיטוי מקומי (פובידון-יוד) כדי להפחית את עומס המיקרופלורה בעור ולהסיר שיער רופף. יש לנקות ממרכז העור, לפעול כלפי חוץ כדי למנוע זיהום חוזר של מקום החתך. חזור על התהליך באמצעות 70% אתנול. בצע שלושה סבבים לסירוגין של יוד ואתנול לחיטוי.
    2. הניחו וילון כירורגי על החיה. זה נחתך ומעוצב מחתיכת מגבת נייר סטרילית או שקית חיטוי.
13. פרשו מגבות נייר סטריליות או שקיות חיטוי לכלים כירורגיים.
14. בדוק אם יש רפלקס via 'בדיקת צביטה' כדי להבטיח הרדמה מספקת לפני המשך ההליך.

3. הזרקת צוואר פנימית

} הערה: בניסוי זה, נעשה שימוש בצינורית עירוי 31 G ובמערך מזרק המופעל על ידי כף הרגל כדי להקל על הליך ההזרקה. הגדרה זו היא אופציונלית, והמשתמש יכול להשתמש במזרק אינסולין 31 גרם ולדלג על שלבים 3.11 ו-3.12. כדי להכין את צינורית העירוי, משוך והפרד את חלק המחט מהחלק המתאים למזרק של מחט 31 גרם באמצעות שני זוגות תפרים clamps. לאחר מכן, חבר את חלק המחט לקצה אחד של צינור עירוי דק באורך של כ -10 ס"מ.

1. מקם את מיקרוסקופ הדיסקציה מעל העכבר.
2. בעזרת מספריים, בצע חתך אנכי של 15 מ"מ לאורך קו האמצע באזור הצוואר החל מ -5 מ"מ מתחת ללסת ועד כניסת בית החזה.
3. בעזרת שני זוגות מלקחיים זוויתיים, חלקו את העור ובלוטות הרוק שמתחתיו והשתמשו במחזירים כדי לשמור על קנה הנשימה חשוף. השלב הבא יחשוף את מעטפת הצוואר המקבילה לקנה הנשימה.
4. בעזרת שני זוגות מלקחיים בעלי זווית עדינה, נתחו בצורה בוטה את השריר ורקמת השומן הסמוכים לקנה הנשימה כדי לחשוף את מעטפת הצוואר הימנית. מעטפת הצוואר היא השכבה הסיבית המכסה את עורק הצוואר המשותף, הווריד ועצב הנרתיק, וניתן לדמיין צרור זה על ידי עורק הצוואר המשותף האדום הבוהק. במחקר זה, ההזרקה בוצעה בעורק הצוואר הימני.
5. נקה קטע מעורק הצוואר המשותף לפיצול הצוואר של הפאשיה שמסביב והפרד אותו מהעצב התועה והוורידים.
6. לבודד ולנקות את התפצלות הצוואר (הצומת המצטרף לעורקי הצוואר החיצוניים והפנימיים) מהעצבים והפאשיה שמסביב. מקם מלקחיים עדינים מתחת לעורק הצוואר החיצוני והעביר תפר משי (עובי 5-0) מתחת לעורק. קושרים ומהדקים את התפר וחותכים את הקו העודף.
   הערה: ליגטורה זו (L1) תמנע מהזרקה לעבור דרך עורק הצוואר החיצוני.
7. מקם מלקחיים עדינים מתחת לעורק הצוואר המשותף והעביר תפר משי (עובי 5-0) מתחת לעורק. קשרו קשר והדקו את התפר במיקום קרוב לאתר ההזרקה המוצע. חותכים את התפר העודף ומשאירים כ -10 מ"מ קו.
   הערה: }קשירה שנייה זו (L2) תגביל את זרימת הדם והדימום לאחר ההזרקה. הוא משמש גם למיקום והחזקת עורק הצוואר במהלך ההזרקה.
8. חותכים ומרטיבים רצועה של מגבים חד פעמיים בעלי מוך נמוך (חיטוי) בגודל של כ-10 מ"מ על 5 מ"מ. קפלו את הרצועה ל-4 מ"מ על 5 מ"מ, בעובי 2-3 מ"מ, והניחו אותה מתחת לעורק הצוואר באתר ההזרקה המוצע. זה יתמוך בכלי במהלך ההזרקה.
9. על עורק הצוואר המשותף לאתר ההזרקה המוצע, הנח קשירה שלישית (L3) עם קשר רופף. זה מהודק רק לאחר ההזרקה (בשלב 3.16).
10. ערבבו בעדינות את תרחיף התאים ומשכו 200 מיקרוליטר של תרחיף תאים למזרק אינסולין (עם מחט 31 גרם).
11. טען את המזרק לנהג המזרק, המחובר לדוושת רגל מפעילה.
12. חבר צינורית דקה עם מחט 31 גרם למזרק ופתח את הקו.
13. בדוק אם עורק הצוואר ממוקם היטב ובלחץ.
14. בעזרת שני מלקחיים בזווית עדינה, האחד נמתח בעדינות על קצה הקשירה הראשונה והשני אוחז במחט 31 גרם, הכנס לאט את המחט עם שיפוע כלפי מעלה לתוך לומן כלי הדם תוך הקפדה לא לנקב אותה.
15. הזרקו לאט 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים (משלב 1.13) לעורק הצוואר המשותף במהירות של 10 מיקרוליטר לשנייה. זה יעביר 2.5 × 10^5 תאים לכלי הדם. הזרקה מוצלחת היא ויזואלית באמצעות{{TAG_398} פינוי הדם מכלי הדם הצוואר.
16. הרם והדק בעדינות את הרצועה הרופפת (L3) (משלב 3.9) מיד לאחר משיכת המחט כדי למנוע זרימה חוזרת ודימום. חתוך תפרים עודפים.
    הערה: זה נורמלי לראות כמות קטנה של דם זולג לאחר הוצאת המחט. עם זאת, אסור שיהיה דימום פעיל לאחר הידוק הקשירה השלישית.
17. הסר את חתיכת המגבים החד פעמיים הלחים עם מוך נמוך.
18. בעזרת פיפטה P200 יש לשטוף את חלל הניתוח פעמיים עם 150-200 מיקרוליטר מים סטריליים או מי מלח.
19. בדוק שוב אם יש דימום ואז הסר את המחזירים.
20. מקם מחדש את הרקמות הרכות, בלוטות הרוק והעור מעל עורק הצוואר וקנה הנשימה.
21. סגור את שכבת העור של החתך באמצעות מחזיק מחט תפרים, מלקחיים ותפר מונופילמנט 6/0 נספג או לא נספג בדפוס רציף.
22. השליכו את מזרק מחט הצינורית והכינו הגדרה חדשה לעכבר הבא. שימוש במזרק חדש יבטיח שמספר התאים המוזרקים לכל עכבר יהיה עקבי.
    הערה: תמונות מייצגות של ההליך נמצאות ב אם הכלי מנוקב או נקרע על ידי המחט, מסומן על ידי דליפת הזרקה או דימום, ההליך נחשב לא מוצלח. לאחר מכן, יש למשוך את המחט, ולהדק מיד את הרצועה השלישית כדי למנוע דימום נוסף. אם הדימום מתמשך לאחר הידוק התפר, יש להמית את החיה באמצעות פנטוברביטל.

4. התאוששות לאחר הזרקה

1. יש להזריק בופרנורפין (50 מיקרוגרם/ק"ג) ומלוקסיקם (1 מ"ג/ק"ג) } באמצעות הזרקה תת עורית כשיכוך כאבים לאחר ניתוח.
2. העבירו את החיה לכלוב חם ונקי כדי להתאושש מההרדמה. זה נורמלי שבעל חיים יהיה בעל פעילות מאופקת (מצטופף ולא פעיל או נע לאט) לאחר ההתעוררות.
3. לאחר 30-45 דקות, העבירו עכברים למתקן החזקה לטווח ארוך.
4. ספקו לעכברים תזונה רכה (ג'ל דיאט, הידרוג'ל, מחית) למשך שבוע לפחות לאחר הניתוח ובדקו את המצב הגופני מדי יום עם תשומת לב מיוחדת לסימני שבץ מוחי, זיהום ודימום סביב מקום הפצע.
5. יומיים לאחר הניתוח, אופייני לבעל החיים להיות בעל פעילות מופחתת, פרווה פרועה קלה ואיבד 15% ממשקל הגוף לפני הניתוח. יש לתת משכך כאבים (מלוקסיקם) מדי יום במשך 2-3 ימים לאחר הניתוח כדי לטפל בכאב ולסייע בהתאוששות.
6. מהיום השלישי ואילך, בעלי החיים חייבים לחזור לפעילות, להגביר את תדירות ההאכלה והטיפוח ולעלות בחזרה במשקל. המתת חסד של בעלי חיים עם ליקויים מתמשכים במצב הגופני (כאב, הצטופפות, חוסר פעילות, ירידה במשקל) לאחר 4 ימים לאחר הניתוח על ידי הזרקת נתרן פנטוברביטל במינון 200 מ"ג/ק"ג {{}} הזרקה תוך-צפקית.
7. ניתן לעקוב אחר השתלת הגידול והתקדמותו באמצעות שיטת הרדמה והדמיה לבחירה, כגון הדמיה ביולוגית, MRI או PET/MRI. הדרישה והיכולת לבצע הדמיה כזו יהיו תלויות מטבען במטרות הפרויקט הבודד ובמתקן שבו הוא מתבצע, ובהתאם לסוג תג המדווח על קווי התאים בהם נעשה שימוש, הנגישות של מתקני רדיוכימיה והדמיה גרעינית רלוונטיים.
   הערה: חלק מבעלי החיים עשויים שלא להגיב היטב ולחוות שבץ מוחי למרות הליך מוצלח. לאחר ההליך, יש להמית מיד בעלי חיים המציגים תסמינים כלשהם של מצוקה נוירולוגית (סיבוב ראש ומשיכה לצד אחד, התנהגות מעגלית, גלגול, חבטה, אובדן תפקוד מוטורי).

תוצאות

איור 1: ייצוג סכמטי של פרוטוקול הזרקת עורק הצוואר הפנימי עבור גרורות במוח. הזרקת עורק צוואר פנימית עם קשירת עורק הצוואר החיצוני יכולה לייצר באופן אמין מודל גרורות במוח מסוגי סרטן ראשוניים שונים. בפרוטוקול זה, שלוש קשירה מונחות על עורק הצוואר (מבואר כ-L1-L3 באיור).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
30G Microlance needle	BD	23748
31G מזרק אינסולין Ultra-Fine II	BD	326103
מלקחיים זוויתיים	Proscitech	T67A-SS	מחודד עדין, זוויתי ללא שיניים, קצה 18 מ"מ, אורך 128 מ"מ
מחצלת
אנטיביוטיקה ואנטי-פטריית	ThermoFisher Scientific	15240062
BT-474 (HTB-20) קו תאי סרטן השד	ATCC	HTB-20
Buprenorphine (TEMGESIC)
Countess cell	counter ThermoFisher Scientific	C10227
דיסקציה מיקרוסקופ
אוזן
קוצץ
מלקחיים בזווית עדינה	Proscitech	DEF11063-07	בזווית 45°, קצה חלק, רוחב קצה: 0.4 מ"מ, מידות קצה: 0.4 x 0.3 מ"מ, אורך 9 ס"מ
צינורות עדינים לצינורית, צינורות OD (ב) 1/32, מזהה צינורות (ב) 1/100 אינץ'	קול פארמר	EW-06419-00
סרום בקר עוברי	ThermoFisher Scientific	26140079
תמיסת המלח המאוזנת של האנק ללא סידן ומגנזיום	ThermoFisher Scientific	14170120
Isoflurane
Kimwipes מגבים חד פעמיים מוך נמוך	Kimberly Clark- Kimwipes	Z188964
צ'או
Meloxicam (METACAM)
חרוט אף			מעוצב משפופרת מיקרופוגה
חומר סיכה לעיניים PAA (קרבומר 2 מ"ג/גרם)באוש ולומב	תמיסת פובידון-יוד Betadine	2505692	PPE (כפפה, מסכה, חלוק, רשת שיער)
Retractors	Kent Scientific	SURGI-5001
RPMI 1640 Media	ThermoFisher Scientific	11875093
תפר משי 13 מ"מ 5-0, P3, 45cm	Ethicon	JJ-640G
Sterile normal	salt ThermoFisher Scientific	TM4469
סרט
לוח			קרש חיתוך עטוף בשקית הניתנת לחיטוי.
מספריים כירורגיים	Proscitech	T104	מידות קצה (LxD): 38x7 מ"מ, אורך 115 מ"מ
מלקחיים תפרים/ מלקחיים מעוקלים	Proscitech	T113C	מעוקל, קצה צר מעוגל 2 מ"מ, עם שיניים, אורך 165 מ"מ
:15.75pt;'מחזיק מחט תפר (מחזיק מחט Olsen Hegar)	Proscitech	TC1322-180	אורך 190 מ"מ, מהדק מחגר
נהג מזרק עם דוושת רגל/ UMP3 Ultra micro pump	World Precision Instruments	UMP3-3
T75 בקבוק תרבית רקמות	ThermoFisher Scientific	156499
חוט
Trigene II חומר חיטוי משטחים	Ceva

חום של בעלי חיים אגרוף חשמלי עכבר פירה דביק כירורגי