ניתוח LC-MS/MS של הפרופיל הפרוטאומי של גרגירי נוירומלנין שבודדו מרקמת מוח אנושית

תקציר

מקור: Wulf, M., et.al. פרוטוקול מבוסס מיקרו-דיסקציה בלייזר לניתוח LC-MS/MS של הפרופיל הפרוטאומי של גרגירי נוירומלנין. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מדגים את הניתוח של דגימות פפטיד מגרגירי נוירומלנין (NMGs) שבודדו מרקמת מוח אנושית לאחר המוות. הפפטידים מופרדים תחילה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) ולאחר מכן מנותחים על ידי ספקטרומטריית מסה כדי לקבוע את יחסי המסה למטען שלהם (m/z). פפטידים ממוקדים מפוצלים כדי לזהות שינויים לאחר התרגום והנתונים המתקבלים מושווים למסד נתונים ייחוס כדי לקבוע את הפרופיל הפרוטאומי של NMGs.

פרוטוקול

1. עיכול טריפטי

1. להקפיא דגימות על קרח.
2. יבש לחלוטין את הדגימות ברכז ואקום.
3. מלאו את הדגימה ב-50 מיקרוליטר של מאגר עיכול מתאים, למשל, 50 מ"מ אמוניום ביקרבונט.
4. לאחר תוספת של 1.25 מיקרוליטר של 200 מ"מ 1,4-דיתיותרייטול, דגרו את הדגימות למשך 30 דקות ב-60 מעלות צלזיוס ו-300 סל"ד באמצעות תרמו-מיקסר וקררו אותן לטמפרטורת החדר (RT) לאחר מכן.
5. לאחר מכן, דגרו דגימות ב-RT למשך 30 דקות בחושך לאחר תוספת של 1.36 מיקרוליטר 0.55 M יודואצטמיד.
6. הוסף כמות מתאימה של טריפסין לדגימות ודגר את הדגימות למשך הלילה (~16 שעות) ב-37 מעלות צלזיוס.
} הערה: עבור 1,000,000 מיקרומטר², 0.1 מיקרוגרם טריפסין נמצא מספיק.
7. הוסף 2.6 מיקרוליטר של 10% חומצה טריפלואורואצטית (TFA) לדגימות כדי לעצור את העיכול (ריכוז סופי של 0.5% TFA).
8. יבש לחלוטין את הדגימות באמצעות רכז ואקום. לאחר מכן, מלא דגימות עד לנפח סופי מוגדר עם 0.1% TFA. דגימות NMG מולאו עד 20 מיקרוליטר מתוכם 5 מיקרוליטר שימשו לניסוי ספקטרומטרי מסה (MS) אחד.
9. אחסן את הדגימות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. קבע את ריכוז הפפטידים על ידי ניתוח חומצות אמינו או שיטת כימות מתאימה אחרת (למשל, זיהוי ישיר).
הערה: ייתכן שלא ניתן לכמת כמויות נמוכות של דגימה באמצעות הטכניקות שהוזכרו. כדי להבטיח טעינת דגימה זהה, כל דגימה צריכה להכיל את אותה כמות של רקמה מבודדת, ויש להתייחס לכל דגימה באופן שווה.

2. כרומטוגרפיה נוזלית וספקטרומטריית מסה בעלות ביצועים גבוהים

הערה: הניתוחים הבאים של ספקטרומטריית מסה (MS) של כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) מותאמים למערכת ה-LC הספציפית עם התקן עמודת לכידה וספקטרומטר מסה המשמשים כאן (ראה טבלת חומרים). עבור מערכות LC ו-MS אחרות, מומלץ להתאים פרמטרים.

1. באמצעות התוכנה Xcalibur, התאם את הגדרות ה-HPLC באופן הבא.
   1. עמודת מלכודת: הגדר את הטמפרטורה ל-60 מעלות צלזיוס, קצב הזרימה ל-30 מיקרוליטר לדקה, מאגר ריצה ל-0.1% חומצה טריפלואורואצטית.
   2. עמודת פאזה הפוכה אנליטית C18: הגדרת טמפרטורה ל-60 מעלות צלזיוס, קצב זרימה ל-30 מיקרוליטר לדקה, מאגר ריצה A ל-0.1% חומצה טריפלואורואצטית, הפעלת מאגר B ל-84% אצטוניטריל, ושיפוע ל-5%-30% מאגר רץ B במשך 98 דקות.
      הערה: התאמת השיפוע עשויה להיות בלתי נמנעת ומומלצת בחום בעת שימוש ברקמות או תאים שונים. זמן השיפוע הכולל עשוי להשתנות עקב טעינת הדגימה בתחילת השיפוע ושטיפת הדגימה בסוף השיפוע. השיפוע הכולל בפרוטוקול זה מורכב מטעינת דגימה של 7 דקות ושטיפת עמודות נוספת למשך 15 דקות, וכתוצאה מכך זמן שיפוע כולל של 120 דקות.
2. צור שיטת רכישה תלוית נתונים (DDA) באמצעות XCalibur Instrument Setup, אותה ניתן למצוא בתפריט מפת הדרכים של תוכנת HPLC.
3. בלשונית פרמטרים גלובליים , הגדירו את מצב העירוי כרומטוגרפיה נוזלית, את רוחב שיא צפוי של LC (30 שניות), ואת מצב ברירת מחדל לטעינה (2).
4. המשך ללשונית פרמטרים לסריקה והוסף את הסריקות והמסננים הבאים בסדר שהוזכר: MS OT, MIPS, עוצמה, מצב טעינה, אי הכללה דינמית, ו-ddMS2 OT HCD.
   הגדרות MS ו-DDA אופטימליות עשויות להשתנות עבור ספקטרומטר המסה הספציפי בו נעשה שימוש כמו גם עבור סוג הדגימה ולכן יש להתאים אותן.
5. הכן דגימות על ידי המסת 200-400 ננוגרם של פפטידי דגימה בנפח מוגדר של 0.1% TFA בכניסות בקבוקון זכוכית ספקטרומטרית מסה אינרטית. אם קביעת הריכוז אינה ישימה עקב כמות דגימה נמוכה, ודא טעינת דגימה זהה על ידי השוואת זרם היונים הכולל (TIC).
   הערה: לשם כך, פתח את הקובץ המתקבל של מדידת ספקטרומטרי מסה בתוכנה מתאימה, למשל, FreeStyle, ובדוק את הכרומטוגרמה. העוצמות צריכות להיות דומות עבור כל הדגימות. TIC מייצג מוצג ב-איור 1.
6. לנתח את הנתונים הגולמיים המתקבלים באמצעות תוכנה מתאימה לפרוטאומיקה, כגון MaxQuant, Progenesis QI for Proteomics או Proteome Discoverer, ולבצע ניתוח נתונים סטטיסטיים המבוסס על שאלת המחקר.

3. ניתוח נתונים גולמיים פרוטאומיים באמצעות MaxQuant

1. טען קבצים גולמיים לתוכנת MaxQuant בכותרת הנתונים הגולמיים על ידי לחיצה על טען.
2. הקצו שמות לדוגמה על ידי לחיצה על Set Experiment.
3. הגדר פרמטרים ספציפיים לקבוצה. ראשית, הוסף שינויים. עקב עיבוד הדגימה, בחרו Deamidation (NQ), Oxidation (M), ו-Carbamidomethylation (N-term) כשינויים משתנים, והוסיפו Carbamidomethylation (C) כשינוי קבוע.
4. בחר טריפסין כאנזים עיכול בכרטיסייה עיכול .
5. הוסף את אפשרות הכימות החופשי של התווית LFQ בכרטיסייה כימות חופשי של תווית . אם יש לעבד יותר מ-10 קבצים, בחר באפשרות Fast LFQ כדי לקצר את זמן העיבוד. הוסף את האפשרות iBAQ כמדד לכימות חלבון.
6. ודא שכל שאר הפרמטרים הספציפיים לקבוצה נשארים בהגדרות היצרן.
7. המשיכו ללשונית Global Parameters והוסיפו את קובץ ה-FASTA שנגזר מ-uniprot.org בלשונית Sequences . שנה את כלל המזהה בהתאם והוסף את מזהה הטקסונומיה, במקרה זה, 9606 עבור homo sapiens.
8. לכימות חלבון בחר Unique ו-Razor פפטידים.
9. ודא שכל שאר הפרמטרים הגלובליים נשארים בהגדרות היצרן.
10. לחץ על התחל ואחזר את הפלט proteingroups.txt לאחר ניתוח MaxQuant להמשך ניתוח בפרסאוס.

תוצאות

איור 1: זרם יונים כולל (TIC) של מדידת DDA של 120 דקות. הכרומטוגרמה מציגה את השפע היחסי של היונים המתאימים לפפטידים הנפלטים בטווח זמן השמירה שבין 0 ל-~105 דקות. מכי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1,4-dithiothreitol	AppliChem	A1101
Acetonitrile	Merck	1.00029.2500
אמוניום ביקרבונט	Sigma-Aldrich	A6141
חומצה פורמית	Sigma-Aldrich	56302
Iodoacetamide	AppliChem	A1666,0100
Micro Tube 500	Carl Zeiss	415190-9221-000
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGAAPFADBMBHQ<
PALM MicroBeam	Zeiss	494800-0014-000
trifluoroacetic acid	Merck <
Trypsin sequencing grade	Serva	37283.01<
Ultimate 3000 RSLC nano LC system	Thermo Fisher Scientific	ULTIM3000RSLCNANO
שם התוכנה	Weblink/Company	Version
FreeStyle	Thermo Fisher Scientific	1.6
MaxQuant	https://www.maxquant.org/	1.6.17.0	<
Zeiss	4.6 pro
Perseus	https://www.maxquant.org/perseus/	1.6.15.0<
Skyline	https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view	20.2.0.343
XCalibur	Thermo Fisher Scientific	4.3

td style='border-left-style:none;border-top-style:none;width:120pt;'> td style='border-left-style:none;border-top-style:none;width:143pt;'>91707td style='border-left-style:none;border-top-style:none;width:120pt;'> td style='border-top-style:none;height:15.5pt;width:206pt;'>PALMRobotd style='border-left-style:none;border-top-style:none;width:120pt;'>