$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. יצירת ספרואידים של גידול בגודל הניתן לשחזור
- אסוף את ה-Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant neurospheres (NS) וצנטריפוגה ב-170 x g למשך 10 דקות (דקות) בטמפרטורת החדר (RT).
- כדי לפרק את ה-NS, דגרו 500 מיקרוליטר מתמיסת האקוטאז למשך 3 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
- לנטרל את תמיסת ה-accutase עם תאי גזע של גידול (TSM) בינוני 7 וצנטריפוגה השעיית תאים ב-355 x g למשך 5 דקות ב-RT.
- השעו מחדש את כדור התא ב-1 מ"ל של מדיום TSM ולאחר מכן הפעילו את התאים באמצעות תא ספירת תאים.
- לדלל את מתלה התא כדי לקבל 2.5-5 x 103 תאים/מ"ל וזרע 100 מיקרוליטר/באר לתוך לוחות תחתונים עגולים עם חיבור נמוך במיוחד (ULA) 96 בארות (ראה Table of Materials). השתמש בצפיפות תאים מתאימה כדי להשיג NS בודד בקוטר ~300 מיקרומטר, 4 ימים לאחר זריעת התאים (250-500 תאים / באר לתאי גליומה אגרסיביים ביותר).
- אשר חזותית את היווצרות ה-NS באמצעות מיקרוסקופ הפוך 4 ימים לאחר זריעת התאים.
2. הכנת המגיב לתיוג נוגדנים (ALR)/קומפלקס נוגדנים והגדרה לבדיקת ההגירה
- שקול את מספר הבארות כדי לנתח ולחשב את הנפח הדרוש לכל מגיב. כלול גם את הבארות הדרושות לבקרות השליליות. בדוק את ה-NS ויזואלית באמצעות מיקרוסקופ הפוך לפני שמתחילים.
- השתמש בצלחות שטוחות עם 96 בארות. בצע את הציפוי. למחקר זה, מטריצת קרום הבסיס (BMM) משמשת כציפוי דק.
- לאחר שהציפוי מוכן, הסר את ציפוי ה-BMM העודף בעזרת קצה p200, הנח את הקצה על קצה הבאר והימנע מלגעת בתחתית. אם אתה עובד עם מספר בארות, השתמש בפיפטה רב-ערוצית.
- חותכים קצה p200, לוקחים 50 מיקרוליטר ממדיום התא + NS מכל באר שנבחרה, ומעבירים אותו לבאר תחתונה שטוחה מצופה. בדוק את הנוכחות והמיקום של ה-NS בכל באר באופן ויזואלי.
NOTE: כל NS חייב להיות ממוקם במרכז הבאר. הימנע מלהישען על קצה הבאר במהלך ההעברה אך זרוק את המדיום במרכז הבאר מבלי לגעת בתחתית. עבור תאים נודדים מאוד, שקול מספר גבוה יותר של שכפולים מאשר שלושת השכפולים הסטנדרטיים. הסיבה לכך היא שכאשר NS יושב קרוב מדי לקצה הבאר, התאים הנודדים עשויים לכסות שטח קטן יותר של הבאר. - הוסף 100 מיקרוליטר מים סטריליים ל-ALR כדי להחזיר לחות למגיב (ריכוז סופי = 0.5 מ"ג/מ"ל). פיפטה כדי לערבב את הפתרון. הערה: המגיב רגיש לאור; לכן, שמור בחושך. יש לצרף את שאריות המגיב ולאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס (הימנע מהקפאה והפשרה).
- מערבבים את הנוגדן עם ALR במצע גידול התאים השלם המתאים בצלחת עגולה עם תחתית מרובת בארות או בצינור ענבר ולהגן מפני אור. הכן כמות מספקת כדי להוציא 50 מיקרוליטר לבאר בריכוז הבדיקה הסופי פי 3. דגירה ב- RT למשך 15 דקות.
- יש לדלל את מגיב מדכא הרקע (BSR) במדיום TSM (או אמצעי גידול תאים מתאים לקו התאים לבחירה) ב-1.5 מ"מ (3x) כדי לקבל בסוף הבדיקה ריכוז סופי של 0.5 מ"מ.
NOTE: המגיב רגיש לאור. ראה לעיל נהלי טיפול טובים. - הוסף בעדינות 50 מיקרוליטר של ה-BSR לכל באר.
- הוסף בעדינות 50 מיקרוליטר של ALR/נוגדן לכל באר. המתן 2 או 3 דקות כדי לתת לריאגנטים להתערבב ובדוק ויזואלית באמצעות מיקרוסקופ הפוך כדי לוודא שרוב ה-NS המשוכפל ממוקם במרכז הבאר.
- הימנע מהיווצרות בועות והסר את כל הקיימות באמצעות מחט. העבירו בעדינות את הצלחת במכשיר ניתוח התאים החיים המוצב בתוך החממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, 95% לחות.
3. הגדרת מכשיר לניתוח תאים חיים לרכישת תמונה
- סרוק את הלוחות באמצעות מכשיר ניתוח התאים החיים (למפרטים, ראה טבלה של Materials) עם מרווחי סריקה החל מנקודת הזמן אפס (t0) של מבחני הפלישה וההגירה שהוגדרו, בהתאמה, לאחר שלב 2.14. ו-3.10. עד 96 שעות.
NOTE: ודא שאתה מסוגל להיפטר ממכשיר ניתוח התאים החיים מיד לאחר תחילת בדיקת הפלישה והנדידה. בהתאם לסוג הגידול, תאים יכולים להתחיל לפלוש או לנדוד מה-NS כבר תוך שעה אחת ממערך הבדיקה. - בתוכנת מכשיר ניתוח התאים החיים, בחר באפשרות Schedule to Purchase. לחץ על + tab ובחר באפשרות Scan on Schedule.
- בחלון התוכנה Create or Restore Vessel, לחץ על האפשרות סגנון חדש.
- בחר את היישום הספציפי במכשיר ניתוח התאים החיים לרכישת הפלישה וההגירה. בחר spheroid scan type, 4x objective, שלב+שדה בהיר ו-ירוק ערוצי תמונה לבדיקת הפלישה. בחר דילול שיבוט סוג סריקה, 4x objective ו- שלב ו- Green לבדיקת ההעברה.
- בחר את סוג הלוח והגדר את הבארות לסריקה על ידי הדגשתן במפת הלוחות.
- הגדר את תדירות הסריקה (עבור הניסויים בפרוטוקול זה תדירות הסריקה הייתה 15 דקות לפלישה ו-30 דקות להנדידה).
- לחץ על הוסף ללוח הזמנים והתחל את הסריקה.