אפיון ספרואידים של גידול נוירואנדוקריני במעי הדק באמצעות אימונופלואורסצנציה

תקציר

מקור: Ear, P. H., et. al. הקמה ואפיון של ספרואידים של גידול נוירואנדוקריני במעי הדק. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים את הצביעה האימונופלואורסצנטית של ספרואידים של גידול נוירואנדוקריני במעי הדק. הספרואידים מקובעים, חדירים ונחסמים ולאחר מכן מודגרים בנוגדנים ראשוניים ומשניים. צבע מתווסף לגרעיני צביעה לפני הרכבתם והדמתם תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

פרוטוקול

1. איסוף גידול נוירואנדוקריני במעי הדק (SBNET) ודיסוציאציה של תאים

1. השג דגימות SBNET של מטופלים שנכרתו לאחר אישור רקמת הגידול מליבת הפתולוגיה הכירורגית.
2. חותכים SBNETs לקוביות של 5 מ"מ ומאחסנים אותם ב-25 מ"ל של מדיום הנשר השונה (DMEM)/F12 של Dulbecco בצינור חרוטי להובלה למעבדה.
3. העבירו את הגידולים ל-DMEM המכיל 1% סרום בקר עוברי או FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין (Pen/Strep), ו-1% גלוטמין (Wash Medium), ודגרו במדיום הכביסה הזה למשך 15 דקות.
4. העבירו את הגידולים לכלי חדש וטחנו אותם לחתיכות בקוטר של פחות מ-1 מ"מ באמצעות מספריים מעוקלים סטריליים.
5. העבירו את הרקמות הטחונות לצינור חדש של 50 מ"ל המכיל 25 מ"ל של Wash Medium.
6. צנטריפוגה של הדגימה ב-500 x g למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
7. יש להשליך את הסופרנטנט ולהשעות מחדש את הכדורים ב-10 מ"ל של Wash Medium המכיל קולגנאז (100 U/mL) ו-DNase (0.1 מ"ג/מ"ל).
8. אפשר לעכל את הגידולים הטחונים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור איטי (50 סל"ד) למשך 1.5 שעות.

2. תרבית של SBNETs כספרואידים של גידול במטריצה אקסטרה תאית (ECM)

1. לאחר השלמת העיכול (שלב 1.8), צנטריפוגה ב-500 x g למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-15 מ"ל של Wash Medium.
2. הנח מסננת תאים של 70 מיקרומטר על גבי צינור חדש של 50 מ"ל והעביר 10 מ"ל של מדיום הכביסה מעל מסננת התאים. סובב את מדיום הכביסה כדי לכסות את הצד של צינור הפלסטיק כדי למנוע מתאי NET להידבק לצד צינור הפלסטיק.
3. סנן את מתלה התאים דרך מסננת תאים.
4. צנטריפוגה ב-500 x g למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, השליכו את הסופרנטנט, השעו מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של Wash Medium (הנפח הכולל הוא ~ 250 מיקרוליטר), והניחו אותה על קרח.
5. העבר 5 מיקרוליטר תאים ל-500 מיקרוליטר של מדיום כביסה (גורם דילול 1/100). השתמש בתאים המדוללים לספירת תאים באמצעות המוציטומטר כדי לקבל את מספר התאים למיליליטר. הכפל ב-100 כדי לתקן את גורם הדילול.
6. הכפל את מספר התאים למ"ל המתקבל בשלב 2.5 בנפח הכולל של תאים בהשעיה המתקבל בשלב 2.4 (~ 250 מיקרוליטר).
7. צנטריפוגה ב-500 x g למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ב-ECM נוזלי (1 x 10⁶ תאים/מ"ל), והמשיכו על הקרח.
8. העבירו 5-20 מיקרוליטר של ספרואידים SBNET ב-ECM לצלחת של 96 בארות ואפשרו ל-ECM הנוזלי להתמצק על ידי הנחת הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
9. הוסף 200 מיקרוליטר של מדיום תרבית SBNET (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% PEN/STREP + 1% גלוטמין + 10 מ"מ ניקוטינאמיד + 10 מיקרוגרם/מ"ל אינסולין) לכל באר של צלחת 96 הבארות המכיל את הספרואידים SBNET ב-ECM.
10. לחלופין, תרבית אורגנואידים SBNET במדיה של תאי גזע בדומה למה שתואר בעבר לגידול אורגנואידים בכבד אנושי או בלבלב ומופיע ב-טבלת החומרים.
11. החלף מדיה כל 5-7 ימים.

3. אפיון ספרואידים SBNETS על ידי אימונופלואורסצנטי

1. העבר את האורגנואידים שגדלו ב-ECM לשפופרת של 1.5 מ"ל באמצעות פיפטה P1000.
2. צנטריפוגה ב-1,500 x g למשך דקה אחת ולהסיר את הסופרנטנט.
3. שטפו את תרבית האורגנואידים על ידי הוספת 1 מ"ל של מי מלח פוספט או PBS, ערבבו, צנטריפוגה ב-1,500 x g למשך דקה אחת והוציאו את הסופרנטנט.
4. תקן את האורגנואידים על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד ודגירה למשך 15 דקות.
5. } שטוף את התרבית פעמיים עם 1 מ"ל של PBS.
6. חדירה לתרבית על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של PBS + 3% אלבומין בסרום בקר או BSA + 0.1% טריטון X 100 למשך 5 דקות.
7. לאחר מכן, שטפו שלוש פעמים עם 1 מ"ל PBS + 3% BSA.
8. דגירה למשך שעה אחת עם נוגדנים ראשוניים נגד סינפטופיזין (SYP) בדילול של 1/600 או כרומוגרנין A (CgA) וקולטן סומטוסטטין 2 (SSTR2) בדילול של 1/400 במאגר נוגדנים (2.5% אלבומין בסרום בקר, 0.1% נתרן אזיד, 25 מ"מ טריס pH 7.4, 150 מ"מ נתרן כלורי).
   הערה: השתמש ב-300 מיקרוליטר או יותר של תמיסת נוגדנים לכל שפופרת.
9. יש לשטוף שלוש פעמים עם 1 מ"ל PBS + 3% BSA.
10. דגירה עם נוגדנים משניים המחוברים ל-FITC בדילול של 1/500 במאגר הנוגדנים למשך שעה. השתמש ב-300 מיקרוליטר או יותר של תמיסת נוגדנים לכל צינור.
11. יש לשטוף 3 פעמים עם 1 מ"ל PBS + 3% BSA. הקפידו לשאוף ולזרוק את כל הסופרנטנט.
12. הוסף 5 מיקרוליטר של אמצעי הרכבה המכיל את הכתם הגרעיני DAPI.
13. השתמש בפיפטה P20 כדי להעביר 5 מיקרוליטר של ספרואידים SBNET משלב 4.12 למגלשת זכוכית ולאטום עם החלקת כיסוי.
14. צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות המטרות 10x, 20x או 40x.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Anti-rabbit FITC	Jackson ImmunoResearch	11-095-152	זוג נוגדנים משני לפלואורופור ירוק<
Agilent Dako	Not Available	מערכת אוטומטית לצביעת
מיכל הקפאת תאים	Thermo Scientific	5100-0001	מיכל להקפאת תאים
CellSence	Olympus	Version 1.18	תוכנת מחשב לשימוש במיקרוסקופ
Chromogranin A antibody	Abcam-45179	RB-9003-PO	נוגדנים ל-IF
Collagenase	Sigma	C0130	אנזים לעיכול רקמת
DMEM	Gibco	11965-092	בינוני להכנת רקמות
DMEM/F12	Gibco	11320-033	בינוני לתרביות אורגנואידים
DNAse	Sigma	DN25	אנזים לעיכול רקמת
FBS	Gibco	16000044	Reagent for culture media
מיקרוסקופ פלואורסצנטי	Olympus	CKX35	מיקרוסקופ לצילום תמונות של ספרואידים
Glutamine	Gibco	A2916801	Reagent for culture media
Insulin	Sigma	I0516	Reagent for Culture media
Matrigel	Corning	356235	מטריצה להטמעה ועיגון של אורגנואידים
מדיום הרכבה (VECTASHIELD)	מעבדות וקטור	H-1200	מקבע לתאים מסומנים עם כתם
Nicotinamide	Sigma	72340	Reagent for culture media
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	מגיב לתיקון תאים
PEN/STREP	Gibco	15140-122	Reagent for culture media
SSTR2 antibody	GeneScritp	A01591	נוגדנים ל-IF
Synaptophysin antibody	Abcam	32127	נוגדנים ל-IF
TritonX	Mallinckrodt	3555 KBGE	מגיב לחדירת תאים
Y-2763 מעכב ROCK	Adipogen	AG-CR1-3564-M005	כדי לשפר את הכדאיות של SBNET spheroid לאחר הפשרה בהקפאה

td style='height:14.5pt; רוחב: 149 נקודות;' >Autostainer Link 48 נוגדנים פלואורסצנטי גידול גידול SBENT גרעיני