מדידת קצב צריכת החמצן בפרוסות מוח חריפות של עכבר

תקציר

מקור: Zhi, L. et al., מדידת קצב צריכת החמצן בפרוסות סטריאטליות חריפות מעכברים בוגרים. J. Vis. Exp. (2022).

סרטון זה מדגים כיצד למדוד את קצב צריכת החמצן המיטוכונדריאלי (OCR) בפרוסות מוח סטריאטליות של עכברים. הוא מפרט את השלבים להכנת לוחית הרקמה ומחסנית החיישן, טעינתם למנתח השטף, ומסביר את התהליכים התאיים העומדים בבסיס דפוסי OCR.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המתאימה לבעלי חיים.

1. חיישני מחסנית לחות (יום אחד לפני הבדיקה)

1. פתח את ערכת בדיקת השטף החוץ-תאי (ראה טבלת החומרים) והסר גם את מחסנית החיישן (ירוק) וגם את לוחית השירות (שקוף; איור 1A). הנח את מחסנית החיישן בצד (חיישנים למעלה) ואל תיגע בחיישנים.
2. הוסף 600 מיקרוליטר של תמיסת קליברנט (pH 7.4) לכל באר של לוחית השירות. הנח את מחסנית החיישן על גבי לוחית השירות וטבל את החיישנים בתמיסת הקליברנט. ודא שהחריץ המשולש של כלי השירות ולוחית מחסנית החיישן מיושרים כהלכה (איור 1B).
3. אטום את ערכת בדיקת השטף החוץ-תאי עם סרט איטום כדי למנוע אידוי של תמיסת הקליברנט, ולאחר מכן הנח אותה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ללא תוספת CO₂ או חמצן למשך הלילה.

2. הכן את לוחית הרקמה (ביום הבדיקה)

1. פתח את לוחית המיקרו-צלחת לכידת האי והוציא את לוחית האי לישיבה ברקמות.
2. לחמם נפח מתאים (625 מיקרוליטר לבאר) של נוזל מוחי מלאכותי שעבר שינוי מחומצן מראש (ACSF, הרכב 140 מ"מ NaCl, 2.5 מ"מ KCl, 2.4 מ"מ CaCl₂, 1.3 מ"מ MgSO₄, 0.3 מ"מ KH₂PO₄, 25 מ"מ גלוקוז, 10 מ"מ HEPES, pH 7.2) חוצץ עד 37 מעלות צלזיוס בצינור של 50 מ"ל. לאחר מכן הוסף BSA לריכוז סופי של 4 מ"ג/מ"ל כדי להכין את מאגר הנשימה. באופן כללי, 50 מ"ל מספיקים לצלחת אחת.
3. הוסף 625 מיקרוליטר של מאגר נשימה (מאגר ACSF מחומצן מראש עם 25 מ"מ גלוקוז ו-4 מ"ג/מ"ל BSA) לכל באר של צלחת האי בזהירות והימנע מטלטול הצלחת. ודא שאין שאריות טיפות על גבי מחסנית החיישן ואין בועות אוויר במאגר של כל באר.

3. הכנת פרוסות סטריאטליות חריפות ומיקום פרוסות כריתה

1. ערוף את ראשו של העכבר לאחר פריקת צוואר הרחם ומיד לנתח את המוח ב-10 מ"ל של תמיסת חיתוך מחומצנת מראש כקרח (125 מ"מ NaCl, 2.5 מ"מ KCl, 26 מ"מ NaHCO₃, 3.7 מ"מ MgSO₄, 0.3 מ"מ KH₂PO₄, 10 מ"מ גלוקוז, pH 7.4).
2. חתך פרוסות סטריאטליות עטרה עם ויברטום בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים) בעובי של 150 מיקרומטר בתמיסת חיתוך קרה כקרח, מחומצנת מראש.
3. שחזר את הפרוסות ב-50 מ"ל של ACSF מחומצן (125 מ"מ NaCl, 2.5 מ"מ KCl, 26 מ"מ NaHCO₃, 2.4 מ"מ CaCl₂, 1.3 מ"מ MgSO₄, 0.3 מ"מ KH₂PO₄, 10 מ"מ גלוקוז, 2 מ"מ HEPES, pH 7.4) ולשמור בתמיסה עד 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
4. לאחר ההתאוששות, העבירו את הפרוסות לצלחת פטרי בגודל 35 מ"מ על 10 מ"מ עם 5 מ"ל מאגר נשימה.
5. השתמש באגרוף ביופסיה מפלדת אל-חלד (למשל, קוטר 1.5 מ"מ) כדי ליצור פיסת רקמה עגולה באזור הרצוי של המוח החתוך שמור את הפרוסה במאגר תוך לחיצה עדינה כלפי מטה עם האגרוף. ודא שהאגרוף נדחף כלפי מטה מספיק חזק כדי לחתוך את הרקמה. הסר את שאר הרקמה, הרם את האגרוף והסר את פיסת הרקמה העגולה לתוך המאגר.
6. חותכים את הקצה של קצה פיפטה של 1 מ"ל כדי ליצור חור בקוטר 1.5-2.0 מ"מ והשתמשו בו כדי להחזיק ולהעביר את הפרוסה המנוקבת לחלק העליון של מסך הלכידה. שאבו חתיכה אחת של רקמת מוח מנוקבת והניחו בזהירות את הרקמה על צד הרשת של מסך הלכידה (איור 2A). מסך הלכידה יהיה חתיכת פלסטיק עגולה עם הרשת המחוברת לצד אחד.
   הערה: מסכי הלכידה כלולים בחבילת המיקרו-פלטות (ראה טבלת חומרים).
7. השתמש בעדינות בממחטת נייר כדי לייבש את מסך הלכידה לזמן קצר. עם הסרת הלחות, הרקמה הופכת לדביקה, מה שמאפשר לפרוסה להיצמד למרכז הרשת. אל תייבש את הפרוסה יותר מדי, מכיוון שהיא תיפגע אחרת.
8. החזיקו את פרוסת מסך הלכידה כלפי מטה בעזרת פינצטה והניחו אותה באחת הבארות של צלחת האי הדגירה (איור 2B). היזהר לא להפיל את הפרוסה; אם כן, הוציאו את המסך והניחו עליו פרוסה חדשה.
   הערה: אל תניח פרוסות מוח לתוך שתי בארות תיקון הרקע (A1 ו-D6) בצלחת האי.
9. דגרו את צלחת האי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה למשך 30 דקות לפחות כדי לאפשר איזון טמפרטורה ו-pH לפני הפעלת הבדיקה.

4. טעינת מחסניות בתרכובות רצויות

1. לדלל את התרכובות הרצויות ב-ACSF מותאם (37 מעלות צלזיוס) לריכוז המלאי הסופי של 10x, 11x, 12x ו-13x מריכוז העבודה עבור יציאות A עד D, בהתאמה, ולהתאים ל-pH 7.4. הבדיקה תנהל את התרכובות לפי הסדר מיציאה A ל-D. לניסוי זה נעשה שימוש בתמיסות הבאות, כאשר ריכוז העבודה שלהם הוזכר לפניהם: 10 מ"מ פירובט (יציאה A), 20 מיקרומטר אוליגומיצין (יציאה B), 10 מיקרומטר או ריכוזים אחרים של קרבוניל ציאניד 4-(טריפלואורומטוקסי) פנילהידרזון (FCCP) (יציאה C), ו-20 מיקרומטר אנטימיצין A (יציאה D).
2. טען בעדינות 75 מיקרוליטר מהתרכובות המדוללות לתוך יציאות ההזרקה המתאימות של מחסנית החיישן. הנח את הקצוות באמצע יציאות ההזרקה בזווית של 45° כשהקצה צמוד לדופן יציאת ההזרקה. אין להכניס טיפים לחלוטין לתחתית יציאות ההזרקה מכיוון שהדבר עלול לגרום לדליפה מורכבת דרך היציאה.
3. משוך את הטיפים מהיציאות בזהירות כדי למנוע יצירת בועות אוויר. אל תקיש על חלק כלשהו של המחסנית כדי למנוע הקלה על בועות אוויר.
4. בדוק ויזואלית את יציאות ההזרקה לטעינה אחידה. ודא שכל הנוזלים נמצאים ביציאה ואין טיפות שאריות על גבי המחסנית.
5. הנח את מחסנית החיישן על לוחית השירות והכניס אותה לאינקובטור (non-CO₂) למשך 30 דקות כדי לאפשר לה להתחמם שוב עד 37 מעלות צלזיוס. טפל בזהירות על ידי אחיזה בלוחית השירות בלבד. זוז כמה שפחות.

5. כיול וביצוע הבדיקה

1. טען את תבנית הבדיקה בתוכנה. לחץ על הכפתור הירוק START .
2. הקפד לטעון את הפרוטוקול הנכון. הפרוטוקול מכיל שילוב של רצפי מדידה של 3 דקות, 3 דקות המתנה ו-2 דקות מדידה (שלושת השלבים הללו יוצרים מדידה אחת). שנה את המרחק של ראש הגשושית מ-26,600 ל-27,800 בהגדרות החומרה תחת הגדרות המכשיר. אין צורך להחליף את ראש הבדיקה עבור מנתח XFe24. הקש START.
3. טען את מחסנית החיישן על לוחית השירות לתוך מגש המכשירים. החריץ עובר בפינה השמאלית הקדמית. ודא שהצלחת יושבת כהלכה ושטוחה. טען את מחסנית החיישן המלאה בתרופות לתוך המנתח לכיול.
4. בצע את ההוראות שעל המסך כדי לכייל ולאזן את החיישנים. זה לוקח בערך 30 דקות.
5. לאחר סיום שלב הכיול, הסר את לוחית הכיול והחלף אותה בצלחת האי (המכילה את פרוסות הרשת והרקמות).
6. מדוד את צריכת החמצן בכל באר של הצלחת באמצעות פרוטוקולי הבדיקה. הפרוטוקול מכיל שילוב של ערבוב של 3 דקות, המתנה של 3 דקות ורצפי מדידה של 2 דקות (שלושת השלבים הללו מהווים מדידה אחת), ובשלב זה מחושב קצב צריכת החמצן (OCR).
7. עבור הניסוי כולו, כלול מדידות OCR פי 4 ליצירת קו בסיס, ולאחר מכן הזרקת יציאה A (פירובט) עם מדידות פי 4, לאחר מכן הזרקת יציאה B (אוליגומיצין) עם מדידות פי 8, לאחר מכן הזרקת יציאה C (FCCP) עם מדידות פי 5, ולבסוף, הזרקת יציאה D (אנטימיצין A) עם מדידות פי 6.
   הערה: מספר מדידות זה לאחר כל הזרקת תרכובת נקבע בהתאם למועד שבו המדידה מגיעה לרמה.
8. נתח את נתוני מדידת ה-OCR ואת נתוני יעילות הצימוד.

תוצאות

איור 1: תמונות המציגות את חיישני מחסנית ההידראט של מנתח השטף החוץ-תאי. (A) מחסנית החיישן היושבת על גבי לוחית כיול (לוחית שירות). (B) מבט מהצד של לוחית השירות ולוחית מחסנית החיישן. החריץ המשולש של לוחית מחסנית השירות והחי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Accumet AB150 pH benchtop meter	Thermo Fisher Scientific	13-636-AB150	to measure pH
Antimycin A from Streptomyces sp.	SIGMA	A8674	כדי לעכב קומפלקס III של המיטוכונדריה
Bobeef Serum Albumin (BSA)	SIGMA	A6003	to make artificial cerebrain spine fluid (BSA-ACSF)
Carbonyl cyanide 4-( trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)	SIGMA	C2920	to unpairation mitochondrial respiration
D-Glucose	SIGMA	G8270	to make artificial brain cerespinal fluid (ACSF)
DMSO	SIGMA	D8418	To dissovle compounds
HEPES	SIGMA	H3375	to make artificial brain cerespinal fluid (ACSF)
חממה לחה שאינה פחמן דו חמצני	Fisher Scientific	11-683-230D	to hydration plates ב-37°C
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes	SIGMA	O4876	to inhibit mitochondrial ATP synthase
Parafilm	SIGMA-ALDRICH		Sealing film
Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL	Seahorse Bioscience	103681-100	פתרון לכיול סוסון ים
Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer	Seahorse Bioscience		ציוד המשמש לניתוח קצב צריכת החמצן, הדור הישן
Seahorse XFe24 מנתח שטף חוץ-תאי	Seahorse Bioscience		ציוד המשמש לניתוח קצב צריכת החמצן, דור חדש
Seahorse XF24 FluxPaks	Seahorse Bioscience	101174-100	חבילה של מחסניות חיישן מנתח שטף, לוחות תרבית רקמות, מסכי לכידה, תמיסת קליברנט ולוחות כיול; ערכת בדיקה.
נתרן פירובט<	P2256	כדי למנוע אילוצים מגבילים את המצע של היצע המצע<
אגרוף ביופסיה מנירוסטה	Miltex		התקן המשמש לניקוב פרוסות
צלחת תרבית תאים סטרילית, 35 x 10 מ"מ	Eppendrof	30700102	משמש לניקוב פרוסה
Vibratome	Leica	VT1200	to slice brain
אמבט מים	Thermo Scientific Precision	282-115	to חוצץ חום ופתרונות

td style='גלישה:מוסתר;ריפוד:0px 3px;יישור אנכי:למעלה;'>SIGMAtr style='height:19px;' > tissue