מדידות מבוססות עכבה של פלישת תאי סרטן המוח

תקציר

מקור: Mudduluru, G., et. al. מדידה בזמן אמת מבוססת עכבה של נדידה ופלישה של תאים סרטניים. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מדגים בדיקה מבוססת עכבה למדידת פלישה ונדידה של תאי גליובלסטומה. תאים משפילים את המטריצה החוץ-תאית, עוברים דרך ממברנות מיקרו-נקבוביות ונצמדים לאלקטרודות, ויוצרים עכבה. ניתוח זה בזמן אמת משקף את הפוטנציאל הפולשני שלהם ליישומי חקר סרטן.

פרוטוקול

1. הכנת מערכת ניתוח תאים בזמן אמת, לוחות פלישה והגירה של תאים (CIM) ותאי U-118MG אלקטרופוטיים לציפוי

1. מקם את מערכת ניתוח התאים בזמן אמת בחממת CO₂ בתנאי תרבית 5-6 שעות לפני תחילת הניסוי לייצוב המערכת לתנאי התרבות.
2. לצורך בדיקת הפלישה, צלחת 50 מיקרוליטר של DMEM (מדיום רגיל) המכילה ג'ל מטריצה חוץ-תאית (ECM) ב-0.1 מיקרוגרם/מיקרוליטר בכל באר של החדר העליון של צלחת ה-CIM. כדי למנוע בועות אוויר, השתמש בשיטת הפיפטינג ההפוך. הסר מיד 30 מיקרוליטר של ג'ל ECM והשאיר 20 מיקרוליטר בבאר.
3. לאחר ציפוי הג'ל ECM, שמור את הצלחת בחממה בתנאי תרבית למשך 4 שעות עם מכסה. במהלך הציפוי והייבוש של ג'ל ECM, יש לנקוט באמצעי מניעה כדי למנוע מגע ישיר עם האלקטרודות של החדר העליון של הלוחות עם הידיים, המשטחים של ארון הבטיחות הביולוגית, או החממה CO_{{}}2.
4. כדי להגדיר את תוכנית מדידת העכבה, לחץ פעמיים על סמל התוכנה המשויך (ראה טבלת חומרים) כדי לפתוח את יישום תוכנת המערכת (יחידת בקרה). לכל עריסה יש חלון אינדיבידואלי עם כרטיסיות שונות להגדרת תנאי הניסוי, העכבה, מדידת מרווח הזמן ומשך הזמן וניתוח הנתונים.
5. תחת הכרטיסייה Layout, הגדר בארות מרובעות לכל מצב ביולוגי והגדר מדידות עכבה דו-שלבית תחת הכרטיסייה Schedule. השלב הראשון הוא למדידת בסיס חד פעמית (טאטא אחד במרווח של דקה), והשלב השני הוא מדידת עכבת התא בעריסות בודדות בהתאמה לניסוי בפועל. עבור נדידה, השתמש ב-145 טאטאות במרווח של 10 דקות, ועבור פלישה, 577 טאטאות במרווח של 10 דקות, מוגדר בנפרד) בעריסות בודדות בהתאמה.
6. שעה לפני תחילת מדידת עכבת התא, הוסף 160 מיקרוליטר של DMEM עם 10% FBS כחומר משיכה כימי לבארות החדר התחתון של הצלחת. הרכיבו את החדר העליון המכיל את הבארות המצופות ג'ל ECM או בארות לא מצופות עם החדר התחתון כדי למדוד פלישה ונדידה, בהתאמה.
7. מלאו את הבארות בתא העליון ב -50 מיקרוליטר של מדיום סרום נמוך והניחו אותם בעריסת המערכת. בדוק אם כל הבארות מזוהות על ידי יחידת הבקרה על ידי לחיצה על הכרטיסייה Message. אם ההודעה מוצגת כ-OK, הצלחת בעריסה מוכנה לניסוי.
8. דגור מראש את הצלחות הארוזות לחלוטין בחממה בתנאי תרבית למשך שעה אחת לפני המדידות בעריסת מערכת ניתוח התאים בזמן אמת, החיוני להתאקלמות של צלחת ארוזה לתנאי תרבית התאים.
9. לקצירת תאים שטופלו במדיום סרום נמוך, שטפו את התאים הגדלים בכלי תרבית עם 1x PBS והוסיפו 2 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA (חומצה אתילנדיאמינטטראצטית). מניחים בחממה למשך 30 שניות ומסירים את הטריפסין-EDTA. אסוף תאים במדיום הסרום הנמוך לתוך שפופרת של 15 מ"ל וספור את התאים {{}} באמצעות מונה תאים אוטומטי כף יד.
10. לאחר הספירה, תאי צנטריפוגה ב-100 x g למשך 5 דקות והשליכו את הסופרנטנט.
11. השהה מחדש 800,000 תאים ב-800 מיקרוליטר של מדיום סרום נמוך לצורך מבחני הנדידה והפלישה. בנוסף, השעו מחדש 300,000 תאים ב-2 מ"ל של מדיום תרבית וזרע בצלחת של 35 מ"מ לניתוח כתמים מערביים כדי לאשר את ההדחה המווסתת של Crk ו-CrkL.

2. קריאת בסיס, זריעת התאים, ומדידה וויזואליזציה של עכבת תאים

1. מדדו את קריאת קו הבסיס על ידי לחיצה על כפתור העריסה } התחל. יש לקרוא את קו הבסיס לאחר דגירה מוקדמת של הצלחות למשך שעה אחת בעריסת מערכת ניתוח התאים בזמן אמת בתנאי תרבית בחממת הפחמן הדו חמצני ולפני זריעת התאים לבארות המתאימות בתא העליון.
   הערה: ברגע שהעריסה } התחל, יחידת הבקרה תשאל אם לשמור את הקובץ הניסיוני. לאחר שמירת הקובץ, מנתח העריסה מודד את עכבת התא הבסיסית כפי שהוגדרה בתוכנית בתחילה ונכנס למצב השהיה עד ללחיצה נוספת על כפתור }Start כדי למדוד את עכבת התא בשלב השני.
2. הוציאו את שתי הלוחות לנדידה ופלישה מהעריסות לאחר מדידת הבסיס ושמרו אותם בארון הבטיחות הביולוגית.
3. זרע 100 מיקרוליטר של תאים (100,000 תאים) בריבועים עבור כל מצב ביולוגי בתא העליון של לוחית ה-CIM בבארות המתאימות כפי שתוכנן ביחידת הבקרה של העריסה על ידי פיפטינג הפוך כדי למנוע בועות אוויר.
4. לאחר הזריעה, שמור את הצלחת מתחת לארון בטיחות ביולוגית למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לתאים להתיישב באופן שווה לתחתית. העבר את הצלחת בחזרה לעריסה המתאימה ולחץ על כפתור התחלת העריסה כדי להתחיל למדוד את עכבת התא כפי שתוכנן בשלב השני של 1.5.
5. לאחר הסריקה האחרונה, הניסוי מסתיים, והתוצאות נשמרות אוטומטית.
6. תחת הכרטיסייה ניתוח נתונים, דמיין את השינויים בעכבת התא כאינדקס תאים באופן תלוי זמן במהלך או אחרי השלמת הניסוי. ניתן להמחיש כל אחד מהתנאים המתאימים של ריבועים בנפרד או כממוצעים ו/או סטיות תקן על ידי לחיצה על התיבות } אפשרויות עבור ממוצע וסטיית תקן.
7. כדי לייצא נתוני אינדקס תאים לקובץ גיליון אלקטרוני, פתח קובץ גיליון אלקטרוני ריק, מקם את הסמן באמצע החלון } ניתוח נתונים ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני. בתיבת הדו-שיח שמופיעה, בחר באפשרות העתק נתונים לתבנית רשימה, והדבק את הנתונים בגיליון האלקטרוני הפתוח.
8. התאם את הזמן בנתונים הגולמיים כדי לייצג את זמן ההתחלה בפועל של מדידת עכבת התא. שעת ההתחלה של השלב השני מוגדרת כאפס.
   הערה: ליחידת הבקרה יש אפשרות להשיג את אינדקס התאים עם או בלי נורמליזציה (כלומר, אינדקס תאים מנורמל) ולהציג את התוצאות כמצגת גרפית באופן תלוי זמן. בדוגמה זו, נתוני אינדקס תאים מיוצאים ללא נורמליזציה לצורך עיבוד והצגה גרפית.
9. שחררו את הניסוי על ידי לחיצה על כפתור Release בכל עריסה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Biosafety cabinet	ThermoFisher Scientific	1300 Series Class II, Type A2
CIM plates	Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc	5665825001	Cell Invasion and migration plates
מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM)	ATCC	302002	מדיום תרבית המשמש לתא culture
תמיסת מלח חוצצת פוספט של Dulbecco (DPBS)	Gibco	21-031-CV	DPBS המשמש לשטיפת התאים
סרום בקר עוברי (FBS)	Hyclone	SH30910.03
חממת פחמן דו חמצני Heracell VIOS 160i	ThermoFisher Scientific	51030285	Carbon dioxide incubator
Matrigel	BD Bioscience	354234	Extracellular matrix
RTCA software	חטיבת ניתוח התאים של Agilent Technologies, Inc		מכשיר המשמש לניסוי
Scepter	Millipore	C85360	מונה
Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
U-118MG	ATCC	ATCC HTB15	קווי תאים המשמשים לניסויים
xCELLigence RTCA DP	Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc	380601050

gel תאים אוטומטי כף יד