פיתוח מודל לחץ טרנסלמינרי באמצעות מערכת אוטונומית טרנסלמינרית

תקציר

מקור: Sharma, T. P., et al., מודל מערכת אוטונומית טרנסלמינרית לאפנון לחץ תוך עיני ותוך גולגולתי במקטעים אחוריים של תורם אנושי. J. Vis. Exp. (2020).

סרטון זה מדגים את הליך הכנת העין האנושית לחקר ההשפעות של לחץ טרנסלמינרי על איתות תאי גנגליון ברשתית על ידי הדמיית לחצים תוך עיניים ותוך גולגולתיים במערכת אוטונומית טרנסלמינארית.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות ה-IRB של המכון.

1. הכנה ועיקור של ציוד ואספקה

1. עיין בטבלת החומרים לרשימה מלאה של האספקה הנדרשת, כמו גם מספרי ספקים וקטלוגים.
2. לפני השימוש, יש לעקר את כל הציוד והמכשירים על ידי חיטוי או שימוש באמפולות אתילן אוקסיד.

2. הכנת מדיום פרפוזיה

1. הוסף 1% פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL פניצילין, 10,000 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין ב-0.85% NaCl) ו-1% L-גלוטמין (200 מ"מ) ל-1,000 מ"ל גלוקוז גבוה מדיום הנשר המותאם של דולבקו (DMEM).
2. עקר את מדיום הזלוף על ידי מעבר דרך פילטר של 0.22 מיקרומטר.

3. הגדרת מערכת אוטונומית טרנסלמינרית (TAS)

1. הגדרת מזרקי זרימה (מאגרי לחץ תוך עיני (IOP) ולחץ תוך גולגולתי (ICP)).
   1. הוסף 30 מ"ל ממדיום הזלוף (סעיף 2) למזרק של 30 מ"ל. חבר תא עצירה תלת כיווני למזרק 30 מ"ל. חבר מסנן הידרופילי של 0.22 מיקרומטר לתא העצירה התלת-כיווני. חבר מתאם בדל 15 G Luer למסנן ההידרופילי של 0.22 מיקרומטר.
   2. הסר בועות אוויר ממערך המזרק. חבר צינורות למתאם בדל 15 G Luer. סגור את היציאה הצדדית של תא העצירה עם מכסה נעילה אוניברסלי לא מאוורר. חזור על הפעולה בסך הכל שתי הגדרות.
   3. סמן מזרק אחד כלחץ תוך גולגולתי ערוץ 1 (CH1 ICP) ואת המזרק השני כלחץ תוך עיני ערוץ 2 (CH2 IOP).
2. הגדר מזרקי זרימה (מאגרי IOP ו-ICP).
   1. חבר תא עצירה תלת כיווני למזרק של 30 מ"ל. חבר מתאם בדל 15 G Luer לתא העצירה התלת-כיווני. חבר צינורות למתאם בדל 15 G Luer.
   2. סגור את היציאה הצדדית של תא העצירה עם מכסה נעילה אוניברסלי לא מאוורר. חזור על הפעולה בסך הכל שתי הגדרות. סמן מזרק אחד כ-CH1 ICP ואת המזרק השני כ-CH2 IOP.

4. הכנת כדור העין האנושי השלם

} הערה: אם מתקבלות עיניים שלמות, בצע את ההליך שלהלן כדי להפריד את המקטע הקדמי מהחלק האחורי של העין. אם העיניים מתקבלות חצויות, התחל בשלב 4.4.

1. יש להניח עין שלמה בתמיסת הפובידון היוד למשך 2 דקות.
2. יש לשטוף את העין בתמיסה סטרילית עם חוצץ פוספט (PBS) כדי להסיר את הפובידון יוד. חזור על הפעולה פעמיים.
3. הסר את האדנקסה, מכל כדור העין באמצעות מלקחיים ומספריים. חצו את העין בקו המשווה כדי להפריד בין המקטעים הקדמיים והאחוריים של העין.
4. הסר את מעטפת עצב הראייה. הסר את ההומור הזגוגי מהקטע האחורי.
5. חתוך סקלרה נוספת מהחלק האחורי, במידת הצורך, כדי להבטיח התאמה טובה לכיפה העגולה של תא ה-IOP (התחתון). בעזרת מלקחיים יש לוודא שהרשתית מפוזרת באופן שווה על החלק האחורי של הקטע.
6. הגדרת תא IOP (תחתון)
   1. מקם את המקטע האחורי האנושי לתוך תא ה-IOP (התחתון) של ה-TAS מעל הכיפה העגולה כשעצב הראייה פונה למעלה.
   2. אטום את הקטע האחורי באמצעות טבעת ה-O של שרף האפוקסי עם ארבעה ברגים, והבטיח איטום הדוק.
   3. הכנס את הצינור ליציאות ה-IN וה-OUT של תא ה-IOP (התחתון). מזרק זרימת ה-IOP עם צינור המכיל מדיום מוכנס ליציאת ה-IN ומזרק יציאת ה-IOP הריק עם הצינור מוכנס ליציאת ה-OUT.
   4. השתמש בשיטת הדחיפה/משיכה כדי להחדיר לאט את מדיום הזלוף לתוך יציאת הזרימה כדי למלא את כוס העין האחורית ובמקביל למשוך לאט את מדיום הזלוף החוצה דרך מזרק הזרימה כדי להסיר בועות אוויר מהקווים. הפסק להחדיר את המדיום ברגע שצינורות ה-IN וה-OUT ריקים מבועות אוויר.
   5. נעל את פקקי העצירה במצב כבוי. הסר את מזרק ה-30 מ"ל ממכלול המסנן של יציאת IOP IN ומלא אותו מחדש ב-30 מ"ל של מדיום. לאחר מכן, החלף את המזרק במכלול המסנן.
7. הגדרת תא ICP (עליון)
   1. הנח את תא/מכסה ה-ICP (העליון) מעל החלק האחורי של הקטע האחורי. ודא שעצב הראייה נמצא בתוך החדר העליון. אטום את החדר העליון עם ארבעה ברגים.
   2. הכנס את הצינור ליציאות ה-IN וה-OUT של תא ה-ICP (העליון). מזרק זרימת ה-ICP עם צינור המכיל מדיום מוכנס ליציאת ה-IN ומזרק ה-ICP הריק עם הצינור מוכנס ליציאת ה-OUT.
   3. החדירו בעדינות ובאטיות את המדיום לתוך יציאת ה-IN כדי למלא את תא ה-ICP ולהסיר בועות אוויר מהקווים בשיטת דחיפה/משיכה. הפסק להחדיר את המדיום ברגע שתא ה-ICP וצינורות ה-IN וה-OUT ריקים מבועות אוויר.
   4. נעל את פקקי העצירה במצב כבוי. הסר את מזרק ה-30 מ"ל ממכלול מסנן ה-ICP ביציאה ומלא אותו מחדש ב-30 מ"ל של מדיום. לאחר מכן, החלף את המזרק במכלול המסנן.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
#122, 1-1/8" בפנים x 1-5/16 אינץ' קוטר חיצוני, טבעת O של ויטון, עובי 3/32 אינץ', 755 דורומטר 50 חבילה	Amazon	B07DRGPPZJ
114 Buna-N O-Ring, מד אורך 70A, שחור, 5/8 אינץ' ID, 13/16 אינץ' OD, 3/32 אינץ' רוחב (חבילה של 100)<	B000FMYRHK
30 מ"ל מזרקים ללא מחט	Vitality Medical	302832
עצירה תלת כיוונית, 2 מנעולי לואר נקבה, מנעול לואר זכר מסתובב, כובע מאוורר<	2C6201
4-40 X 1/2 PH PAN MS SS/CHROME & מברג פיליפס בגודל מתאים	Brikksen מחברי נירוסטה	PPMSSSCH4C.5
ANPROLENE 16 LARGE AMPULE	Fisher Scientific	NC9085343
Betadine	Purdue	PUR1815001EACH
Corning 100 x 20mm Tissue Culture-Processing מנות תרבות	Sigma-Aldrich	CLS430167-100EA
Corning L-glutamine Solution	Fisher Scientific	MT25005CI
Covidien 3033 Curity Gauze Sponge, 4 אינץ' x 4 אינץ', 12 שכבות, סטרילי, 1200/CS	Med Plus Medical Supply	COV-3033-CS
חבישת מלקחיים עדינים מעוקלים (משוננים)	Katena	K5-4010
Dumont #5 - מלקחיים עדינים	F.S.T.	11254-20
מספריים לעיניים Standard Curved	Katena	K4-7410
Falcon 150 x 15 מ"מ צלחות פטרי חד פעמיות סטריליות רגילות	Capitol Scientific	351058
פישרברנד 4 אונקיות. מיכלי דגימה	פישר סיינטיפיק	16-320-730
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches	Fisher Scientific	01-812-54
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches	Fisher Scientific	01-812-55
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches	Fisher Scientific	01-812-58
HyClone Modified Eagles Medium	Fisher Scientific	SH3024302
HyClone Penicillin Streptomycin 100X Solution	Fisher Scientific	SV30010
מסנן הידרופילי עם כניסת נעילת לואר נקבה, יציאת החלקה לואר זכר, כחול ושקוף	Qosina	28217
מתמרי לחץ הידרוסטטיים, DELTRAN ® II, קטלוג # DPT-200 עם קצב זרימה של 3CC/HR	AD instruments	DPT-200
JG15-0.5HPX 15 מד 0.5 אינץ' NT פרימיום סדרת טיפ חלוקה 50/Box	Jenson Global	JG15-0.5HPX 15
Keyence B2‐X710 microscope	Keyence	B2-X710
LabChart 8	AD instruments	LabChart 8
Leica ST5020 Multi-stainer	Leica	ST5020
מכסה מנעול לואר אוניברסלי לא מאוורר, לבן	QOSINA	65811
מגבר גשר אוקטלי (דגם # FE228)	AD instruments	FE228
Pharmco Products ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF	Fisher Scientific	NC1675398
Phosphate Buffered Solution (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
PowerLab 8/35 (Model # PL3508)	AD instruments	PL3508
ProLong Gold Antifade Mountant עם DAPI	ThermoFisher	P36935
התאמת צינור דחיפה לחיבור למתאם ישר אוויר ומים, 1/8 אינץ' צינור OD x 1/8 NPT זכר	McMAster-Carr	7880T113
התאמת צינור דחיפה לחיבור עם חוט אוניברסלי לאוויר ומים, מתאם, צינור 1/8 אינץ' OD x 1/8 צינור	McMAster-Carr	51235K101
Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 צינורות גמישים 500 רגל.	Fisher Scientific	14-171-268
Superblock T20	Fisher Scientific	PI37536
מספריים כירורגיים - Sharp-Blunt	F.S.T.	14001-14
מלקחיים לרקמות עדינות 1x2 שיניים מעוקלות	Katena	K5-4110
Translaminar Autonomous System (TAS)	המרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת צפון טקסס	N/A
USA גודל 030 O-ring Buna-N, B1000, 70 דורומטר, שחור, Buna-N (NBR, Nitrile, Buna)	Marco Rubber & Plastics	B1000-030

td style='width:174pt;'>Amazontd style='רוחב:174pt;'>QOSINA