בדיקת פגוציטוזיס של תאים חיים של תאים דמויי מיקרוגליה באמצעות סינפטוזומים אנושיים

תקציר

מקור: Funes, S., et. al., תאים דמויי מיקרוגליה אנושיים: התמיינות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים ובדיקת פגוציטוזיס של תאים חיים במבחנה באמצעות סינפטוזומים אנושיים. J. Vis. Exp. (2022)

סרטון זה מדגים מבחן לחקר היכולת הפגוציטית של תאים דמויי מיקרוגליה באמצעות סינפטוזומים פלואורסצנטיים רגישים ל-pH.

פרוטוקול

1. בדיקת פגוציטוזיס של תא חי
   1. לוח 20-30 ×-10⁴ PMPs לתוך צלחות של 96 בארות ב-100 מיקרוליטר של מדיום שלם iMG ועקוב אחר תהליך ההתמיינות במשך 10 ימים.
   2. ביום הבדיקה, הכינו את תמיסת הצביעה הגרעינית על ידי הוספת טיפה אחת של כתם גרעיני לתאים חיים לתוך 2 מ"ל של מדיום בסיסי iMG.
   3. הסר 40 מיקרוליטר של מדיום לכל באר של צלחת 96 בארות והוסף 10 מיקרוליטר מתמיסת הצביעה הגרעינית באמצעות פיפטה רב-ערוצית. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ למשך שעתיים.
   4. הפשירו את הסינפטוזומים המסומנים על קרח ועשו סוניקטור בעדינות באמצעות סוניקטור מים למשך דקה אחת. העבירו מיד את הסינפטוזומים בחזרה לקרח. לדלל את הסינפטוזומים המסומנים במדיום שלם iMG ביחס של 1 מיקרוליטר סינפטוזומים לכל 50 מיקרוליטר של המדיום.
      הערה: ריכוז הסינפטוזום תלוי בבדיקה ועשוי לדרוש אופטימיזציה. כדי לשמור על אחוז נמוך יחסית (כלומר, 0.1% או פחות) של DMSO במדיום, מומלץ לא להוסיף יותר מ-2 מיקרוליטר של סינפטוזומים לבאר.
   5. כבקרה שלילית, טפל מראש בכמה בארות עם ציטוכלזין D כדי לעכב פילמור אקטין ובכך פגוציטוזיס. הכן תמיסה של 60 מיקרומטר ציטוכלזין D במדיום שלם iMG. הוסף 10 מיקרוליטר מתמיסה זו לכל באר לריכוז סופי של 10 מיקרומטר ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ למשך 30 דקות.
   6. הסר את הצלחת מהחממה ודגר ב-10 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. שמור את הצלחת על קרח והוסף 50 מיקרוליטר של מדיום המכיל סינפטוזומים.
   7. צנטריפוגה של הצלחת ב-270 × גרם למשך 3 דקות ב-10 מעלות צלזיוס והחזק את הצלחת על הקרח עד לרכישת ההדמיה.
2. Imaging acquisition and analysis<ol style='list-style-type:decimal;'>
3. הכנס את הלוח לקורא הדמיה של תא חי ובחר את הבארות לניתוח.
4. בחר עדשת אובייקטיבית פי 20.
5. התאם את המיקוד, עוצמת הדיודה פולטת האור (LED), זמן האינטגרציה והרווח של ערוצי השדה הבהיר והכחול (4',6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]). הקרינה הסינפטוזומית צריכה להיות זניחה בנקודת הזמן הראשונית. השתמש בערוץ השדה הבהיר כהתייחסות להתמקדות בערוץ האדום (RFP). זמן האינטגרציה והרווח יכולים להשתנות בין ניסויים; השתמש בהגדרות הראשוניות הבאות עבור הערוץ האדום: LED: 4, זמן אינטגרציה: 250 ורווח: 5.
6. בחר את מספר האריחים הבודדים שיש לרכוש במונטאז' לכל באר (לדוגמה, רכוש 16 אריחים במרכז הבאר, ובכך הדמיה של כ-5% משטח הבאר הכולל). הגדר את הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס ואת מרווח הזמן הרצוי להדמיה.
   הערה: התמונות נרכשו כל שעה עד שעתיים עד 16 שעות במחקר זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חומרי תרבית תאים
Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate<	353872
CellStick Laminin-521	STEMCELL טכנולוגיה	77004	נקרא laminin 521
רכיבים של מדיית בסיס iMG
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634010	ריכוז סופי 1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	ריכוז סופי 1x
תוספת N2, 100x	Gibco	17502-048	ריכוז סופי 1x
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל)	Gibco	15140122	ריכוז סופי 100 U/mL
רכיבי iMG מדיה מלאה
55 mM 2-mercaptoethanol	Gibco	21985023	ריכוז סופי 55 מיקרומטר
IL-34	PeproTech או Biologend	200-34 or 577904	ריכוז סופי 100 ng/mL
iMG base media			ריכוז סופי 1x
M-CSF	PeproTech	300-25	ריכוז סופי 5 ng/mL
TGF-β	PeproTech	100-21	ריכוז סופי 50 ng/mL
Phagocytosis assay dyes
NucBlue Live Ready reagent	Invitrogen	R37605
pHrodo Red, succinimidyl ester	ThermoFisher Scientific	P36600	מכונה צבע
ריאגנטים אחרים של תרבית תאים
Cytochalasin D	Sigma		ריכוז סופי 10 μM
תוכנה וציוד
צנטריפוגה	Eppendorf	Model 5810R
קורא הדמיה של תאים חיים	Biotek
Gen5 Microplate Reader and Imager Software	Biotek	version 3.03

td style='padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Corning רגיש ל-pH