זיהוי טרנספורטר אשלגן-כלוריד עצבי זרחני 2 באמצעות Western Blotting

תקציר

מקור: Josiah, S. S., et al. חקר הפונקציות והפעילויות של K-Cl Co-Transporter KCC2 באמצעות Western Blotting. J. Vis. exp. (2022).

הסרטון מדגים את השלבים לאיתור וכימות חלבון אשלגן-כלוריד זרחני קוטרנספורטר 2 (KCC2) בליזאט תא. תהליך זה כולל משקעים חיסוניים כדי לבודד KCC2 זרחני וכימילומינסנציה כדי לכמת את החלבון המבודד.

פרוטוקול

1. תרבית תאים וטרנספקציה

1. מחממים את כל הריאגנטים באמבט החרוזים (37 מעלות צלזיוס) לפני הליך תרבית התאים. הכינו מדיום תרבית, מדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco, בתוספת 10% סרום בקר עוברי, 1% כל אחד מ-2 מ"מ L-גלוטמין, 100x חומצת אמינו לא חיונית, 100 מ"מ נתרן פירובט ו-100 יחידות/מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין.
2. הפשרה יציבה של חולדה KCC2b כליה עוברית אנושית 293 תאים (HEK293^rnKCC2b) לחלוטין באמבט החרוזים (37 מעלות צלזיוס). העבירו את התאים מהצינור הקריוביאלי לצינור צנטריפוגה המכיל 5 מ"ל של מדיה טרייה. סובב את התא ב-1200 ×גרם למשך 3-5 דקות.
3. השתמש בפיפטה של שואב (מקובעת למשאבת ואקום) כדי לשאוב את הסופרנטנט ולהוסיף 10 מ"ל של מדיה טרייה כדי להשעות מחדש את התאים. העבירו את מתלה התא לצלחת כלים בגודל 10 ס"מ.
4. מניחים את המנה לתוך החממה ומניחים לה לגדול במשך 48 שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס באווירה לחה של 5% CO₂. עקוב אחר תקופת הדגירה כדי להבטיח צמיחת תאים בריאה. פיצול נוסף של התאים כאשר הם הגיעו למעלה מ-90% מפגש לאחר תקופת הדגירה.
5. שאפו את המדיה הישנה מצלחת התאים ושטפו בעדינות תאים עם 2 מ"ל של מי מלח פוספט (PBS). מוסיפים 2 מ"ל טריפסין ודוגרים כ-1-2 דקות בטמפרטורת החדר.
6. השתמש ב-2 מ"ל של מדיה מלאה כדי לשטוף בעדינות את התאים הטריפסינים בכלי. הוסף 9 מ"ל מדיה טרייה למנות חדשות והוסף תמיסה של 1 מ"ל מהמנה הישנה לכל אחת מהחדשות. העבירו את צלחות התאים המפוצלים בחזרה לחממה למשך 48 שעות כדי להגיע למפגש ≥ של 90%.
7. טפל בתאים עם דימתיל סולפוקסיד (DMSO) כבקרה, 8 מיקרומטר סטאורוספורין או 0.5 מ"מ N-אתילמלימיד (NEM) למשך 15 דקות לפני קצירת התאים במאגר ליזה.

2. הכנת ליזטים של תאים וטעינת דגימות

1. שאיפת המדיה על צלחת התרבית (מהליכי טרנספקציה). הניחו את תרבית התאים על קרח ושטפו את התאים עם PBS קר כקרח.
2. שאפו את ה-PBS, ולאחר מכן הוסיפו 1.0 מ"ל של מאגר ליזה קר כקרח המכיל 50 מ"מ tris-HCl (pH 7.5), 1 מ"מ אתילן גליקול-ביס(אתר β-אמינואתיל)-N,N,N′,N′-חומצה טטראצטית (EGTA), 1 מ"מ חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA), 50 מ"מ נתרן פלואוריד, 5 מ"מ נתרן פירופוספט, 10 מ"מ נתרן-β-גליצרופוספט, 1 מ"מ נתרן אורתובנדאט, 1% (w/v) טריטון X-100, 0.27 מ' סוכרוז, 1 מ"מ בנזמין, 0.1% (v/v) 2-מרקפטואתנול ו-2 מ"מ פניל-מתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF) למנה.
   הערה: נפח מאגר הליזיס במהלך קציר התאים משתנה בהתאם לגודל המנה, לדוגמה, 1 מ"ל של מאגר ליזה מתאים לכל 1 x 10⁷ תאים/צלחת 100 מ"מ/150 ס"מ² בקבוק, בעוד ש-0.5 מ"ל מתאים לכל 5 x 10⁶ תאים/צלחת 60 מ"מ/75 ס"מ²} בקבוק.
3. השתמש במגרד תאים מפלסטיק קר כדי לגרד את התאים מתחתית הצלחת, ולאחר מכן השתמש בעדינות בפיפטה כדי להעביר את תרחיף התא לצינור מיקרו-צנטריפוגה שכבר נמצא על קרח. ערבב כל הזמן את הצינור במשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
4. סובב את הליזאטים של התא בצנטריפוגה קרה (4 מעלות צלזיוס) בטמפרטורה של 16,000 x g למשך 20 דקות, הסר את הצינור בעדינות מהצנטריפוגה והנח אותו על קרח. אוספים את הסופרנטנט לתוך שפופרת טרייה מקוררת מראש וזורקים את הגלולה.
   הערה: ייתכן שיהיה צורך לשנות את כוח הצנטריפוגה והזמן בהתאם לסוג התא. עם זאת, הנחיות כלליות מעודדות צנטריפוגה ב-16,000 x g למשך 20 דקות. עם זאת, יש לקבוע זאת עבור כל ניסוי. לדוגמה, תאים עדינים כמו לויקוציטים זקוקים למהירות צנטריפוגה קלה מאוד.

3. הכנת משקעים חיסוניים מליזטים של תאים

1. פיפטה 300 מיקרוליטר של חלבון-G-sepharose לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה. סובב את התמיסה ב-500 x g למשך 2 דקות והשליך את הסופרנטנט.
2. הוסף 500 מיקרוליטר של PBS ומערבל היטב את התמיסה. סובב את התמיסה ב-500 x g למשך 2 דקות והשליך את הסופרנטנט. חזור על שלב זה.
3. מערבבים 1 מ"ג של נוגדנים נגד KCC2 Thr906 ואנטי-KCC2 Thr1007 עם 200 מיקרוליטר של חרוזי חלבון G-sepharose ומרכיבים את הנפח ל-500 מיקרוליטר עם PBS. יש לנער על פלטפורמה רוטטת או גלגל מסתובב למשך שעתיים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
4. בצע כימות חלבון על כל ליזאט התא והוסף 1 מ"ג של ליזאט התא לחרוזים השטופים. דגרו בעדינות במסובב מקצה לקצה למשך שעתיים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. סובבו את החרוזים ושטפו אותם פי 3 עם PBS המכיל 150 מ"מ נתרן כלורי (NaCl).
5. שטפו משקעים חיסוניים (חרוזים) פי 3 עם 200 מיקרוליטר PBS. השעו מחדש את הגלולה הסופית ב-100 מיקרוליטר של מאגר דגימת ליתיום דודציל סולפט (LDS) 1x.
6. מנערים את הצינורות בשייקר רוטור בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות ומדגרים אותם בבלוק חימום בטמפרטורה של 75 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. צנטריפוגה את דגימת הטעינה ב-11,000 x g למשך 2 דקות והשתמש בסופרנטנט להעמסת ג'ל.

4. ביצוע הכתם המערבי

1. הרכיבו את מנגנון היציקה ושפכו ג'ל הפרדה טרי של 8% (ראה טבלה 1 למתכון/הכנה) כדי להטיל את הג'ל ולהשאיר כ-2 ס"מ מרווח מהחלק העליון של זכוכית היציקה. הוסף 200 מיקרוליטר של איזופרופנול מוחלט להתקנה ואפשר לו לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות.
   הערה: מתכון ג'ל פוליאקרילאמיד לאלקטרופורזה של ג'ל נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE) תלוי בגודל החלבון המעניין ( טבלה 2). לפיכך, רשמו את גודל החלבון לפני קביעת אחוז הג'ל הרצוי.
2. השתמש בפיפטה כדי להסיר את האיזופרופנול ושטוף בזהירות את הג'ל בכ-200 מיקרוליטר מים מזוקקים. הוסף ג'ל ערימה טרי של 6% (ראה טבלה 1 למתכון/הכנה) כדי למלא את החלל של כ-2 ס"מ במערך היציקה. מכניסים בעדינות למסרק הבאר ומניחים לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
3. מקבעים את הג'ל היצוק למיכל האלקטרופורזה.
4. ממיסים 30.3 גרם בסיס Tris, 144.1 גרם גליצין ו-10 גרם SDS ב-1000 מ"ל מים מזוקקים להכנת מאגר העברה פי 10. הכן מאגר רץ 1x על ידי הוספת 10 מ"ל של 10% SDS ו-100 מ"ל של מאגר העברה 10x ל-890 מ"ל מים מזוקקים.
5. יוצקים 1x מאגר רץ למיכל. טען 5 מיקרוליטר של סמן משקל מולקולרי לבאר הראשונה וכמות שווה של חלבון לכל באר של ג'ל SDS-PAGE (בין 18-30 מיקרוליטר, תלוי בגודל המסרק בו נעשה שימוש). מלאו בארות ריקות ב-1x LDS והפעילו את הג'ל למשך כ-90-120 דקות ב-120 V.
6. ממיסים 58.2 גרם בסיס טריס ו-29.3 גרם גליצין ב-1000 מ"ל מים מזוקקים כדי להכין מאגר העברה פי 10. הפעל את ממברנת הניטרוצלולוזה עם מאגר העברה 1x המכיל 20% מתנול. שוטפים את הג'ל והקרום עם מאגר ההעברה ומורחים אותם בעדינות על ערימת ההכנה.
   הערה: אין צורך להתאים את ה-pH של מאגרי הריצה וההעברה כפי שהם צריכים להיות ב-pH האופטימלי הנדרש. כמו כן, רצוי להכין את המאגרים הללו ולאחסן אותם בטמפרטורת החדר לפני הניסוי כדי לחסוך זמן.
7. מסדרים את הכריך להעברה בסדר זה: אלקטרודה שלילית (מסגרת / קצה שחור) - קצף כריך - נייר פילטר - ג'ל SDS-PAGE שטוף - קרום ניטרוצלולוזה שטוף - נייר פילטר - קצף כריך - אלקטרודה חיובית (מסגרת אדומה). ערמו את הכריך המורכב במיכל ההעברה והריצו ב-90 וולט למשך 90 דקות או 30 וולט למשך 360 דקות.

5. צביעת נוגדנים ופיתוח תמונה

1. הסר את הממברנה ותן לה להתייבש. חסום את הממברנה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר באמצעות מאגר חוסם העשוי מחלב דל שומן 5% בתמיסת מלח עם Tris-buffered המכילה 0.1% 1x Tween 20 (1x TBS-T).
2. דגרו את הממברנות עם דילולים מתאימים של נוגדנים ראשוניים^8,15,19 ובטא-אקטין (בקרת העמסה) במאגר חוסם למשך שעה בטמפרטורת החדר או לילה ב-4 מעלות צלזיוס. שטפו את הממברנה בשלוש שטיפות של 1x TBS-T למשך 5 דקות כל אחת.
   הערה: הדגירה של הממברנה הנפרדת עם בקרות העמסה כגון נוגדנים בטא-אקטין, אלפא-טובולין או גליצרלדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז היא לנרמל את תוצאות הכתמים המערביים האחרים במהלך הכימות שלאחר מכן. הדילול המומלץ לכל נוגדן ראשוני זמין במדריך היצרן.
3. דגרו את הממברנה השטופה עם נוגדן משני מדולל פי 5000 במאגר חוסם למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. שוב, שטפו את הממברנה 3x ב-1x TBS-T למשך 5 דקות כל אחד.
   הערה: מומלץ מאוד להעלות את הנוגדן המשני כנגד המין שבו הנוגדן הראשוני גדל. לדוגמה, אם הנוגדן העיקרי של סך KCC2 הוא אנטי-KCC2 של עכבר, יש להשתמש בנוגדנים המשני לאנטי-עכבר.
4. הנח את הממברנה השטופה על לוח ההדמיה. מערבבים נפחים שווים של כל מגיב כימילומינסנציה משופרת (ECL) ומורחים בעדינות את התמיסה המעורבת על הממברנה כדי לפתח אותות.

6. רכישת תמונות באמצעות מערכת הדמיה וכימות נתונים

1. העבר את לוח ההדמיה לתא המתאים במערכת ההדמיה להדמיה. פתח את תוכנת ההדמיה במחשב לעיבוד תמונה.
2. בסרגל הכלים, לחץ על פרוטוקול חדש ובחר ערוץ יחיד. לחץ על Select תחת תיבת הדו-שיח gel imaging/application, גלול אל Blot ובחר Chemi Hi Sensitivity או Chemi Hi Resolution. לאחר מכן לחץ על הגדרת צבירת אותות כדי להגדיר את משך ומספר התמונות שיש לרכוש.
3. לחץ על Position Gel תחת הגדרת הפרוטוקול והתאם את הג'ל במערכת ההדמיה במידת הצורך. לחץ על הפעל פרוטוקול כדי להשיג את התמונות.
4. לחץ לחיצה ימנית על אחת התמונות שנרכשו מתחת לתיבת קטלוג ההדמיה כדי לשמור את התמונות במחשב. נווט לתמונה הרצויה ולחץ על בחר תמונה והמשך תחת תיבת הדו-שיח הפעלה.
5. לחץ על הסמל Image Transform כדי להתאים את הניגודיות ואת רוויית הפיקסלים של התמונה. לחץ על הסמל צילום מסך בסרגל הכלים הכללי כדי לשמור את התמונה במחשב בהתאם לפורמט התמונה הרצוי.
6. למדוד את צפיפות הפסים באמצעות תוכנת ImageJ ולנתח באמצעות כלים סטטיסטיים מתאימים.

תוצאות

טבלה 1: מתכון להכנת תערובת ג'ל פוליאקרילאמיד (הפרדה וערימה של תמיסות ג'ל).

8 מ"ל של 8% ג'ל מפריד

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
40% acrylamide	Sigma-Aldrich	A2917	משמש לייצור ג'ל הפרדה וערימה עבור SDS-PAGE
אמוניום לסולפט	Sigma-Aldrich	248614	משמש לייצור ג'ל הפרדה וערימה עבור SDS-PAGE
anti pSPAK	Dundee University	S670B	משמש כנוגדנים ראשוניים לכתמים מערביים
anti-KCC2	אוניברסיטת דנדי	S700C	משמש כנוגדנים ראשוניים לכתמים
anti-KCC2 pSer940	Thermo Fisher Scientific	PA5-95678	משמש כנוגדנים ראשוניים לכתמים מערביים
anti-KCC2 pThr1007	אוניברסיטת דנדי	S961C	משמש כנוגדנים עיקריים לכתמים
anti-KCC2 pThr906	אוניברסיטת דנדי	S959C	משמש כנוגדנים ראשוניים לכתמים
anti-mouse	טכנולוגיית איתות תאים	66002	משמש כנוגדנים משניים לכתמים
anti-NKCC1	Dundee University	S841B	משמש כנוגדנים ראשוניים לכתמים
anti-NKCC1 pThr203/207/212	אוניברסיטת דנדי	S763B	משמש כנוגדנים ראשוניים לכתמים
anti-rabbit	טכנולוגיית איתות תאים	C29F4	משמש כנוגדנים משניים לכתמים
anti-sheep	abcam	ab6900	משמש כנוגדנים משניים לכתמים
anti-SPAK	Dundee University	S669D	משמש כנוגדנים ראשוניים לכתמים
anti-β-Tubulin III	Sigma-Aldrich	T8578	משמש כנוגדן עיקרי לכתמים
Benzamine	Merck UK	135828	משמש כמרכיב של מאגר
Beta-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	משמש כמרכיב של מאגר טעינה ומאגר
Bradford Coomasie	Thermo Scientific	1856209	משמש לכימות חלבון ליזאט
Casting apparatus	Atto	WSE-1165W	משמש להפעלת אלקטרופורזה
צנטריפוגה	Eppendorf	5804	משמש להכנת ליזאט
צנטריפוגה	VWR	MicroStar 17R	משמש לספינינג דוגמאות
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)<	D2650-100ML	משמש לניסוי
חלב דל שומן מיובש	Marvel	N/A	משמש ליצירת מאגר חסימה
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	D6429	משמש לתרבית
מגיב ECL	Perkin Elmer	ORTT755/2655	משמש לפיתוח תמונה עבור Western Blotting
EDTA	Fisher Scientific	D/0700/53	משמש כמרכיב של מאגר
EGTA	Sigma-Aldrich	e4378	משמש כמרכיב של מאגר
ספק כוח אלקטרופורזה	BioRad	PowerPAC HC	כדי לספק חשמל להפעלת SDS-page electrophoresis
Ethanol	ThermoFisher	E/0650DF/17	משמש להכנת ציוד וסביבה
סרום בקר עוברי - מושבת בחום	Merck Life Sciences UK	F9665	משמש לתרבית
Fumehood	Walker	A7277	משמש לתרבית תאים
Gel Blotting - Whatman	GE Healthcare	10426981	משמש בכתמים מערביים ליצירת סנדוויץ
Glycine	Sigma-Aldrich	15527	משמש לייצור חוצצים
GraphPad Prism Software	GraphPad Software, Inc., USA	גרסה 6.0	משמש להתוויית גרפים וניתוח נתונים עבור Western Blotting
HCl	Acros Organics	10647282	משמש להכנת ג'ל הפרדה וערימה עבור SDS-PAGE
בלוק חימום	Grant	QBT1	משמש לחימום דגימות
HEK293 cells	Merck UK	12022001-1VL	קו תאים לניסוי
ImageJ Software	Wayne Rasband and Contributors; NIH, ארה"ב	ImageJ 1.53e	משמש למדידת עוצמות פס מתמונות
מערכת הדמיה	BioRad	ChemiDoc MP	משמש לצילום תמונות
Incubator	LEEC	LEEC precision 190D	משמש לתרבית
Isopropanol	Honeywell	24137	משמש ביציקת ג'ל לאלקטרופורזה
L-glutamine solution	Sigma-Aldrich	G7513	משמש לתרבית תאים
ליתיום דודציל סולפט (LDS)<	NP0008	משמש כמאגר טעינה עבור Western Blotting
MEM חומצת אמינו לא חיונית	Merck Life Sciences UK	M7145	משמש לתא culture
Microcentrifuge	Eppendorf	5418	משמש להכנת ליזטים ל-WB
Microplate reader	BioRad	iMark	משמש לקריאת ריכוז חלבון ליזאט
Microsoft Powerpoint	Microsoft, USA	PowerPoint2016	משמש לעריכת תמונות
סמן משקל מולקולרי	BioRad	1610373	משמש לכתמים
N-ethylmaleimide	Thermo Fisher Scientific	23030	משמש לניסוי
Nitrocellulose membrane	Fisher Scientific	45004091	משמש לכתמים
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	משמש לתרבית תאים
pH Meter	Mettler Toledo	Compact S210	משמש לניטור pH של תמיסות
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626	משמש כמרכיב של מאגר
מאגר פוספט מלוח	Sigma-Aldrich	D8537	משמש לתרבית תאים
PKCδ pThr505	טכנולוגיית איתות תאים	9374	משמש כנוגדנים ראשוניים לכתמים
Sepharose Protein G	Generon	PG50-00-0002	משמש למשקעים
נתרן כלורי<	S7653	משמש כמרכיב של מאגר כביסה
נתרן כלורי<	S7653	משמש להכנת מאגר
נתרן דודציל סולפט	Sigma-Aldrich	L5750	משמש להכנת ג'ל הפרדה וערימה עבור SDS-PAGE
נתרן אורתובנאדאט	Sigma-Aldrich	S6508	משמש כמרכיב של מאגר
נתרן פירובט	Sigma-Aldrich	S8636	משמש לתרבית תאים
נתרן-β-גליצרופוספט	Merck UK	G9422	משמש כמרכיב של מאגר
Staurosporine (from Streptomyces sp.)	Scientific Laboratory Supplies, UK	S4400-1MG	משמש לניסוי
Sucrose	Scientifc Laboratory Supplies	S0389	משמש כמרכיב של מאגר
TEMED	Sigma-Aldrich	T7024	משמש להכנת ג'ל הפרדה וערימה עבור SDS-PAGE
Transfer Chamber	BioRad	1658005EDU	משמש בכתמים מערביים להעברת חלבון על הממברנה
Tris	Sigma-Aldrich	T6066	משמש לייצור ג'ל הפרדה וערימה עבור SDS-PAGE
Triton-X100	Sigma-Aldrich	T8787	משמש כמרכיב של מאגר
פתרון Trypsin-EDTA	Merck Life Sciences UK	T4049	משמש לתרבית תאים
Tween-20	Sigma-Aldrich	P3179	משמש כ-make TBS-T buffer
משאבת ואקום	Charles Austen	Dymax 5	משמש לתרבית תאים
Vortex	Scientific Industries	K-550-GE	משמש להכנת דגימה
מערבל מערבולת	Scientific Industries Ltd	Vortex-Genie K-550-GE	משמש לערבוב דגימה
Water bath	Grant Instruments Ltd. (JB Academy)	JBA5	משמש לדגירת פתרונות

מערביים מערביים מערביים מערביים מערביים מערביים מערביים מערביים מערביים מערביים lysis ליזה של עמוד SDStd style='רוחב:240pt;'>Sigma-Aldrich תרבית תאים תאים ליזה lysis מעוקרים תאים' העברה טעינת WB תרבית כתמים מערביות כתמים מערביים תאיםtd style='width:240pt;'>Novex כתמים מערביות מערביים תרבית תאים מערביים חיץ ליזה מערביים חיסונייםtd style='width:240pt;'>Sigma-Aldrichtd style='רוחב:240pt;'>Sigma-Aldrich TBS-T ליזה lysis תרבית תאים lysis lysis שנפתרה