זיהוי טרנספורטר אשלגן-כלוריד עצבי זרחני 2 באמצעות Western Blotting

תקציר

מקור: Josiah, S. S., et al. חקר הפונקציות והפעילויות של K-Cl Co-Transporter KCC2 באמצעות Western Blotting. J. Vis. exp. (2022).

הסרטון מדגים את השלבים לאיתור וכימות חלבון אשלגן-כלוריד זרחני קוטרנספורטר 2 (KCC2) בליזאט תא. תהליך זה כולל משקעים חיסוניים כדי לבודד KCC2 זרחני וכימילומינסנציה כדי לכמת את החלבון המבודד.

פרוטוקול

1. תרבית תאים וטרנספקציה

1. מחממים את כל הריאגנטים באמבט החרוזים (37 מעלות צלזיוס) לפני הליך תרבית התאים. הכינו מדיום תרבית, מדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco, בתוספת 10% סרום בקר עוברי, 1% כל אחד מ-2 מ"מ L-גלוטמין, 100x חומצת אמינו לא חיונית, 100 מ"מ נתרן פירובט ו-100 יחידות/מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין.
2. הפשרה יציבה של חולדה KCC2b כליה עוברית אנושית 293 תאים (HEK293^rnKCC2b) לחלוטין באמבט החרוזים (37 מעלות צלזיוס). העבירו את התאים מהצינור הקריוביאלי לצינור צנטריפוגה המכיל 5 מ"ל של מדיה טרייה. סובב את התא ב-1200 ×גרם למשך 3-5 דקות.
3. השתמש בפיפטה של שואב (מקובעת למשאבת ואקום) כדי לשאוב את הסופרנטנט ולהוסיף 10 מ"ל של מדיה טרייה כדי להשעות מחדש את התאים. העבירו את מתלה התא לצלחת כלים בגודל 10 ס"מ.
4. מניחים את המנה לתוך החממה ומניחים לה לגדול במשך 48 שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס באווירה לחה של 5% CO₂. עקוב אחר תקופת הדגירה כדי להבטיח צמיחת תאים בריאה. פיצול נוסף של התאים כאשר הם הגיעו למעלה מ-90% מפגש לאחר תקופת הדגירה.
5. שאפו את המדיה הישנה מצלחת התאים ושטפו בעדינות תאים עם 2 מ"ל של מי מלח פוספט (PBS). מוסיפים 2 מ"ל טריפסין ודוגרים כ-1-2 דקות בטמפרטורת החדר.
6. השתמש ב-2 מ"ל של מדיה מלאה כדי לשטוף בעדינות את התאים הטריפסינים בכלי. הוסף 9 מ"ל מדיה טרייה למנות חדשות והוסף תמיסה של 1 מ"ל מהמנה הישנה לכל אחת מהחדשות. העבירו את צלחות התאים המפוצלים בחזרה לחממה למשך 48 שעות כדי להגיע למפגש ≥ של 90%.
7. טפל בתאים עם דימתיל סולפוקסיד (DMSO) כבקרה, 8 מיקרומטר סטאורוספורין או 0.5 מ"מ N-אתילמלימיד (NEM) למשך 15 דקות לפני קצירת התאים במאגר ליזה.

2. הכנת ליזטים של תאים וטעינת דגימות

1. שאיפת המדיה על צלחת התרבית (מהליכי טרנספקציה). הניחו את תרבית התאים על קרח ושטפו את התאים עם PBS קר כקרח.
2. שאפו את ה-PBS, ולאחר מכן הוסיפו 1.0 מ"ל של מאגר ליזה קר כקרח המכיל 50 מ"מ tris-HCl (pH 7.5), 1 מ"מ אתילן גליקול-ביס(אתר β-אמינואתיל)-N,N,N′,N′-חומצה טטראצטית (EGTA), 1 מ"מ חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA), 50 מ"מ נתרן פלואוריד, 5 מ"מ נתרן פירופוספט, 10 מ"מ נתרן-β-גליצרופוספט, 1 מ"מ נתרן אורתובנדאט, 1% (w/v) טריטון X-100, 0.27 מ' סוכרוז, 1 מ"מ בנזמין, 0.1% (v/v) 2-מרקפטואתנול ו-2 מ"מ פניל-מתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF) למנה.
   הערה: נפח מאגר הליזיס במהלך קציר התאים משתנה בהתאם לגודל המנה, לדוגמה, 1 מ"ל של מאגר ליזה מתאים לכל 1 x 10⁷ תאים/צלחת 100 מ"מ/150 ס"מ² בקבוק, בעוד ש-0.5 מ"ל מתאים לכל 5 x 10⁶ תאים/צלחת 60 מ"מ/75 ס"מ²} בקבוק.
3. השתמש במגרד תאים מפלסטיק קר כדי לגרד את התאים מתחתית הצלחת, ולאחר מכן השתמש בעדינות בפיפטה כדי להעביר את תרחיף התא לצינור מיקרו-צנטריפוגה שכבר נמצא על קרח. ערבב כל הזמן את הצינור במשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
4. סובב את הליזאטים של התא בצנטריפוגה קרה (4 מעלות צלזיוס) בטמפרטורה של 16,000 x g למשך 20 דקות, הסר את הצינור בעדינות מהצנטריפוגה והנח אותו על קרח. אוספים את הסופרנטנט לתוך שפופרת טרייה מקוררת מראש וזורקים את הגלולה.
   הערה: ייתכן שיהיה צורך לשנות את כוח הצנטריפוגה והזמן בהתאם לסוג התא. עם זאת, הנחיות כלליות מעודדות צנטריפוגה ב-16,000 x g למשך 20 דקות. עם זאת, יש לקבוע זאת עבור כל ניסוי. לדוגמה, תאים עדינים כמו לויקוציטים זקוקים למהירות צנטריפוגה קלה מאוד.

3. הכנת משקעים חיסוניים מליזטים של תאים

1. פיפטה 300 מיקרוליטר של חלבון-G-sepharose לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה. סובב את התמיסה ב-500 x g למשך 2 דקות והשליך את הסופרנטנט.
2. הוסף 500 מיקרוליטר של PBS ומערבל היטב את התמיסה. סובב את התמיסה ב-500 x g למשך 2 דקות והשליך את הסופרנטנט. חזור על שלב זה.
3. מערבבים 1 מ"ג של נוגדנים נגד KCC2 Thr906 ואנטי-KCC2 Thr1007 עם 200 מיקרוליטר של חרוזי חלבון G-sepharose ומרכיבים את הנפח ל-500 מיקרוליטר עם PBS. יש לנער על פלטפורמה רוטטת או גלגל מסתובב למשך שעתיים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
4. בצע כימות חלבון על כל ליזאט התא והוסף 1 מ"ג של ליזאט התא לחרוזים השטופים. דגרו בעדינות במסובב מקצה לקצה למשך שעתיים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. סובבו את החרוזים ושטפו אותם פי 3 עם PBS המכיל 150 מ"מ נתרן כלורי (NaCl).
5. שטפו משקעים חיסוניים (חרוזים) פי 3 עם 200 מיקרוליטר PBS. השעו מחדש את הגלולה הסופית ב-100 מיקרוליטר של מאגר דגימת ליתיום דודציל סולפט (LDS) 1x.
6. מנערים את הצינורות בשייקר רוטור בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות ומדגרים אותם בבלוק חימום בטמפרטורה של 75 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. צנטריפוגה את דגימת הטעינה ב-11,000 x g למשך 2 דקות והשתמש בסופרנטנט להעמסת ג'ל.

4. ביצוע הכתם המערבי

1. הרכיבו את מנגנון היציקה ושפכו ג'ל הפרדה טרי של 8% (ראה טבלה 1 למתכון/הכנה) כדי להטיל את הג'ל ולהשאיר כ-2 ס"מ מרווח מהחלק העליון של זכוכית היציקה. הוסף 200 מיקרוליטר של איזופרופנול מוחלט להתקנה ואפשר לו לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות.
   הערה: מתכון ג'ל פוליאקרילאמיד לאלקטרופורזה של ג'ל נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE) תלוי בגודל החלבון המעניין ( טבלה 2). לפיכך, רשמו את גודל החלבון לפני קביעת אחוז הג'ל הרצוי.
2. השתמש בפיפטה כדי להסיר את האיזופרופנול ושטוף בזהירות את הג'ל בכ-200 מיקרוליטר מים מזוקקים. הוסף ג'ל ערימה טרי של 6% (ראה טבלה 1 למתכון/הכנה) כדי למלא את החלל של כ-2 ס"מ במערך היציקה. מכניסים בעדינות למסרק הבאר ומניחים לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
3. מקבעים את הג'ל היצוק למיכל האלקטרופורזה.
4. ממיסים 30.3 גרם בסיס Tris, 144.1 גרם גליצין ו-10 גרם SDS ב-1000 מ"ל מים מזוקקים להכנת מאגר העברה פי 10. הכן מאגר רץ 1x על ידי הוספת 10 מ"ל של 10% SDS ו-100 מ"ל של מאגר העברה 10x ל-890 מ"ל מים מזוקקים.
5. יוצקים 1x מאגר רץ למיכל. טען 5 מיקרוליטר של סמן משקל מולקולרי לבאר הראשונה וכמות שווה של חלבון לכל באר של ג'ל SDS-PAGE (בין 18-30 מיקרוליטר, תלוי בגודל המסרק בו נעשה שימוש). מלאו בארות ריקות ב-1x LDS והפעילו את הג'ל למשך כ-90-120 דקות ב-120 V.
6. ממיסים 58.2 גרם בסיס טריס ו-29.3 גרם גליצין ב-1000 מ"ל מים מזוקקים כדי להכין מאגר העברה פי 10. הפעל את ממברנת הניטרוצלולוזה עם מאגר העברה 1x המכיל 20% מתנול. שוטפים את הג'ל והקרום עם מאגר ההעברה ומורחים אותם בעדינות על ערימת ההכנה.
   הערה: אין צורך להתאים את ה-pH של מאגרי הריצה וההעברה כפי שהם צריכים להיות ב-pH האופטימלי הנדרש. כמו כן, רצוי להכין את המאגרים הללו ולאחסן אותם בטמפרטורת החדר לפני הניסוי כדי לחסוך זמן.
7. מסדרים את הכריך להעברה בסדר זה: אלקטרודה שלילית (מסגרת / קצה שחור) - קצף כריך - נייר פילטר - ג'ל SDS-PAGE שטוף - קרום ניטרוצלולוזה שטוף - נייר פילטר - קצף כריך - אלקטרודה חיובית (מסגרת אדומה). ערמו את הכריך המורכב במיכל ההעברה והריצו ב-90 וולט למשך 90 דקות או 30 וולט למשך 360 דקות.

5. צביעת נוגדנים ופיתוח תמונה

1. הסר את הממברנה ותן לה להתייבש. חסום את הממברנה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר באמצעות מאגר חוסם העשוי מחלב דל שומן 5% בתמיסת מלח עם Tris-buffered המכילה 0.1% 1x Tween 20 (1x TBS-T).
2. דגרו את הממברנות עם דילולים מתאימים של נוגדנים ראשוניים^8,15,19 ובטא-אקטין (בקרת העמסה) במאגר חוסם למשך שעה בטמפרטורת החדר או לילה ב-4 מעלות צלזיוס. שטפו את הממברנה בשלוש שטיפות של 1x TBS-T למשך 5 דקות כל אחת.
   הערה: הדגירה של הממברנה הנפרדת עם בקרות העמסה כגון נוגדנים בטא-אקטין, אלפא-טובולין או גליצרלדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז היא לנרמל את תוצאות הכתמים המערביים האחרים במהלך הכימות שלאחר מכן. הדילול המומלץ לכל נוגדן ראשוני זמין במדריך היצרן.
3. דגרו את הממברנה השטופה עם נוגדן משני מדולל פי 5000 במאגר חוסם למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. שוב, שטפו את הממברנה 3x ב-1x TBS-T למשך 5 דקות כל אחד.
   הערה: מומלץ מאוד להעלות את הנוגדן המשני כנגד המין שבו הנוגדן הראשוני גדל. לדוגמה, אם הנוגדן העיקרי של סך KCC2 הוא אנטי-KCC2 של עכבר, יש להשתמש בנוגדנים המשני לאנטי-עכבר.
4. הנח את הממברנה השטופה על לוח ההדמיה. מערבבים נפחים שווים של כל מגיב כימילומינסנציה משופרת (ECL) ומורחים בעדינות את התמיסה המעורבת על הממברנה כדי לפתח אותות.

6. רכישת תמונות באמצעות מערכת הדמיה וכימות נתונים

1. העבר את לוח ההדמיה לתא המתאים במערכת ההדמיה להדמיה. פתח את תוכנת ההדמיה במחשב לעיבוד תמונה.
2. בסרגל הכלים, לחץ על פרוטוקול חדש ובחר ערוץ יחיד. לחץ על Select תחת תיבת הדו-שיח gel imaging/application, גלול אל Blot ובחר Chemi Hi Sensitivity או Chemi Hi Resolution. לאחר מכן לחץ על הגדרת צבירת אותות כדי להגדיר את משך ומספר התמונות שיש לרכוש.
3. לחץ על Position Gel תחת הגדרת הפרוטוקול והתאם את הג'ל במערכת ההדמיה במידת הצורך. לחץ על הפעל פרוטוקול כדי להשיג את התמונות.
4. לחץ לחיצה ימנית על אחת התמונות שנרכשו מתחת לתיבת קטלוג ההדמיה כדי לשמור את התמונות במחשב. נווט לתמונה הרצויה ולחץ על בחר תמונה והמשך תחת תיבת הדו-שיח הפעלה.
5. לחץ על הסמל Image Transform כדי להתאים את הניגודיות ואת רוויית הפיקסלים של התמונה. לחץ על הסמל צילום מסך בסרגל הכלים הכללי כדי לשמור את התמונה במחשב בהתאם לפורמט התמונה הרצוי.
6. למדוד את צפיפות הפסים באמצעות תוכנת ImageJ ולנתח באמצעות כלים סטטיסטיים מתאימים.

תוצאות

טבלה 1: מתכון להכנת תערובת ג'ל פוליאקרילאמיד (הפרדה וערימה של תמיסות ג'ל).

8 מ"ל של 8% ג'ל מפריד

חומרים