כימות סומות תאי גנגליון ברשתית בעקבות יתר לחץ דם עיני המושרה על ידי צריבה

תקציר

מקור: Lani-Louzada, R., et al. צריבה במעגל מלא של מקלעת כלי הדם הלימבלית לגלאוקומה הנגרמת בניתוח במכרסמים. J. Vis. Exp. (2022).

סרטון זה מדגים את הכימות של תאי גנגליון רשתית מרשתית חולדה קבועה כימית הנתונה לצריבה במעגל מלא של מקלעת כלי הדם הלימבלית. התהליך כולל חדירה, צביעת נוגדנים וצביעה נגדית גרעינית, ולאחר מכן הדמיה תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי כדי להעריך את ההשפעה של לחץ תוך עיני מוגבר על כדאיות תאי הגנגליון ברשתית.

פרוטוקול

כל ההליכים הקשורים לדגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לביקורת אתית של בעלי חיים.

1. כימות של סומות תאי גנגליון ברשתית

הערה: ההליך הבא הוא לכימות של סומות RGC, המבוסס על צביעה אימונוהיסטוכימית של תושבות שטוחות ברשתית עם נוגדן כנגד חלבון הומיאובוקס/תחום POU הספציפי למוח 3A (Brn3a).

1. העבירו רשתית מבודדת לתוך צלחת תרבית של 24 בארות (רשתית אחת לבאר) המכילה 1 מ"ל של 1x PBS ושמרו על הרשתית הפנימית כלפי מעלה.
2. לחלחל רקמות על ידי שטיפה 3 פעמים למשך 10 דקות עם חומר פעילי שטח לא יוני 0.5% מדולל ב-1x PBS (0.3 מ"ל). לאחר מכן שמור את הרקמה מנענעת בעדינות באלבומין סרום בקר 5% (BSA) בחומר פעילי שטח לא יוני 2% ו-1x PBS (תמיסה חוסמת; 0.25 מ"ל) למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר.
3. במהלך שלב 1.2, הכינו את תמיסת הנוגדנים העיקרית Brn3a על ידי דילול 1:200 בחומר פעילי שטח לא יוני 0.5% ו-1x PBS בתוספת 5% BSA, ואחסנו אותה ב-4 מעלות צלזיוס.
4. לאחר 60 דקות של חסימת רקמות, דגרו על רשתית ב-0.2 מ"ל של תמיסת נוגדנים ראשונית ב-4 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות עם ניעור עדין.
5. שטפו את הטישו 3 פעמים למשך 10 דקות עם 1x PBS, ולאחר מכן דגרו את הרקמה למשך שעתיים בטמפרטורת החדר ב-0.2 מ"ל של תמיסת הנוגדנים המשנית המדוללת 1:750 ב-1x PBS בתוספת 5% BSA.
6. יתר על כן, דגרו את הרקמה למשך 10 דקות בתמיסת כתמים גרעיניים לצביעת גרעינים פלואורסצנטיים. סיים את האימונוהיסטוכימיה עם שלב שטיפה אחרון עם 1x PBS (0.3 מ"ל) שחוזר על עצמו 3x.
7. העבירו רשתית בעזרת שתי מברשות קטנות על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית, תוך שמירה על הצד הזגוגי כלפי מעלה. מקם את רבע הרשתית הגבי כלפי מעלה על שקופיות המיקרוסקופ. בצע שני חתכים רדיאליים נוספים לכיוון ראש עצב הראייה כדי לתחום את שלושת הרבעים האחרים (אף, גחון וטמפורלי).
   הערה: מידות החיתוך אינן קבועות. הם לא צריכים להיות קצרים מדי הפוגעים בהשטחה יעילה של הרשתית במגלשה ולא צריכים להיות ארוכים מדי כך שהיא תגיע לפתח עצב הראייה ותפריד לחלוטין את רבע הרשתית התחום משאר הרקמה.
8. לבסוף, מרחו 0.2 מ"ל של מדיום הרכבה נגד דהייה על כיסוי זכוכית והניחו אותו על הרשתית השטוחה לניתוח מיקרוסקופי של רקמות. כדי להעריך את צפיפות ה-RGCs, בחן את התושבות השטוחות תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי קונפוקלי באמצעות מטרה של 40x/1.3.
9. עבור כל רבע של הרשתית, צלם שמונה תמונות: שתיים מהרשתית המרכזית (~0.9 מ"מ מהדיסק האופטי), שלוש מאמצע הרשתית (~2.0 מ"מ מהדיסק האופטי), ושלוש מהרשתית ההיקפית (~3.7 מ"מ מהדיסק האופטי), בסך הכל 32 תמונות לכל רשתית. השתמש בתוכנת FIJI כדי לספור תאים חיוביים ל-Brn3a ולהעריך את צפיפות התאים הממוצעת.

חומרים