גירוי של מערכת העצבים התוך-לבבית להערכת רגישות להפרעות קצב

תקציר

מקור: Jungen, C., et al. השפעת נוירונים תוך-לבביים על אלקטרופיזיולוגיה של הלב והפרעות קצב במערכת Ex Vivo Langendorff. J. Vis. Exp. (2018).

הסרטון מדגים טכניקה ex vivo לגירוי מערכת העצבים התוך-לבבית כדי להעריך את רגישות הלב להפרעות קצב. באמצעות מנגנון זלוף, לב עכבר מבודד מוחדר עם מאגר מחומצן. לאחר מכן מגורה מערכת העצבים התוך-לבבית בתדירות גבוהה כדי לגרום להפרעות קצב.

פרוטוקול

כל ההליכים הקשורים לדגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לביקורת אתית של בעלי חיים.

1. הכנת מנגנון לנגנדורף

הערה: נעשה שימוש במערכת זלוף לנגנדורף זמינה מסחרית.

1. הכן תמיסת קרבס-הנסלייט שונה (119 מ"מ נתרן כלורי, 25 מ"מ נתרן ביקרבונט, 4.6 מ"מ אשלגן כלורי, 1.2 מ"מ אשלגן פוספט מונובסיסי, 1.1 מ"מ מגנזיום גופרתי, 2.5 מ"מ סידן כלורי, 8.3 מ"מ גלוקוז ו -2 מ"מ נתרן פירובט). כדי למנוע משקעי סידן, הוסף תערובת של 95% חמצן / 5% פחמן דו חמצני לתמיסת הזילוף. סנן את המאגר בגודל נקבובי של 0.22 מיקרומטר.
2. הוסף חומר פרמקולוגי למאגר כדי לחקור את השפעתו על אלקטרופיזיולוגיה של הלב והפרעות קצב לפי הצורך.
3. התחל את אמבט המים והניח את תמיסת הזלוף הכוללת תערובת של 95% חמצן / 5% פחמן דו חמצני. התאם את הטמפרטורה של אמבט המים, כך שטמפרטורת תמיסת הזלוף ישירות לפני הצינורית תהיה ~37 מעלות צלזיוס.
4. ברגע שמגיעים לטמפרטורה הנכונה, הפעל את משאבת הגליל ומלא את המכשיר בתמיסת הזילוף.
5. כוונן את קצב המשאבה לפני חיבור הלב, כך שלא יישארו בועות אוויר בצינורית בעת הרכבתה למכשיר.

2. הכנה קשה ותוכנה

1. חבר מערכת איסוף נתונים דיגיטלית ואת התוכנה המתאימה לה למנגנון לנגנדורף לרישום רציף של לחץ הזילוף, קצב הזרימה וקצב הלב.
   1. הגדר את לחץ הזלוף הממוקד בהגדרות הכלליות ל-80 מ"מ כספית.
   2. התחל להקליט.
2. להקלטת נתונים וגירוי עם מחולל גירויים דיגיטלי ייעודי, השתמש בצנתר אלקטרופיזיולוגיה עם אלקטרודות פלטינה, משטח אלקטרודה של 0.5 x 0.5 מ"מ ומרווח אלקטרודות של 0.5 מ"מ.
   1. הנח את הצנתר קרוב לאזור שבו הלב ימוקם לאחר החיבור למכשיר.
   2. הכן את הגירוי על ידי בחירת 2 אלקטרודות מהצנתר והשתמש באורך מחזור של 100 אלפיות השנייה.

3. הכנת הלב

1. הוסף את מאגר הזילוף הקר (~2 - 4 מעלות צלזיוס) (10 - 20 מ"ל ו- 40 - 50 מ"ל, כך שכל המנה מכוסה) ל -2 צלחות הפטרי (קוטר של 6 ס"מ ו -10 ס"מ) ואת המנה עם הצינורית, והניחו אותם על קרח ישירות ליד המיקרוסקופ ומתחתיו. מכינים קשר כפול סביב הצינורית.
2. כריתה מהירה של הלב לאחר פריקת צוואר הרחם על ידי פתיחת בית החזה באמצעות מספריים של מאיו ומלקחיים צרים. לאחר מכן אחזו באבי העורקים ובווריד הנבוב מעל הסרעפת באמצעות מלקחיים של לונדון וכרתו את גוש הלב-ריאה על ידי חיתוך כל כלי הדם ורקמת החיבור הקרובים לעמוד השדרה בעזרת מספרי הפזילה.
3. העבירו את גוש הלב-ריאה לתוך הצלחת הראשונה (בקוטר 6 ס"מ) המלאה במאגר קר כקרח והסירו בזהירות את הריאות מבלי לפגוע בלב באמצעות מספריים פזילה ומלקחיים של לונדון. לאחר מכן, הנח את הלב מתחת למיקרוסקופ והסר בזהירות את בלוטת התימוס, הוושט וקנה הנשימה באמצעות מספריים קפיציים ומלקחיים של Dumont SS.
4. השתמש במספריים הקפיציים כדי לחתוך חור של 1.5 - 2 מ"מ בחלקו העליון של האטריום הימני להחדרת הקטטר. חותכים חור בעורק הריאה. לאחר מכן חותכים את אבי העורקים ישירות מתחת לענפים העל-אבי העורקים ומסירים את הרקמה כך שניתן יהיה לחבר את הקשר בקלות.
5. שמור על רפידות השומן הפרוזדוריות, כולל הפרספקס הגנגליוני העיקרי הממוקם בפרוזדורים, סביב הפרוזדור השמאלי שלמות או הסר אותן לחלוטין על ידי דיסקציה זהירה.
6. מעבירים את הלב לכלי עם הצינורית ומניחים אותו מתחת למיקרוסקופ. משוך את אבי העורקים מעל הצינורית בעזרת מלקחיים של Dumont SS וקשר את הקשר המוכן בחוזקה סביב אבי העורקים. ודא שהצינורית לא ממוקמת עמוק מדי באבי העורקים כך ששסתום אבי העורקים וכלי הדם הכליליים יישארו חופשיים.
7. חבר את הצינורית במהירות למנגנון לנגנדורף. וודאו שלא נותרו בועות בצינורית.
8. העבר את לחץ הזלוף ל-80 מ"מ כספית, מה שמאפשר זלוף בלחץ קבוע.
9. הכניסו את הקטטר בזהירות לאטריום הימני ולחדר הימני מבלי לגעת או לפגוע בלב, והצמידו אותו לצינורית בעזרת סרט.
10. התחל את הגירוי עם אורך המחזור המוכן של 100 אלפיות השנייה לתקופת שיווי משקל ראשונית של 20 דקות.
11. סגור את החדר כדי לאפשר טמפרטורה יציבה.

4. פרמטרים אלקטרופיזיולוגיים והפרעות קצב

1. הפעל גירוי מתוכנת באמצעות האלקטרודות הדיסטליות או הפרוקסימליות של הצנתר בקצב כפול מקצב הפרוזדורים או החדר כדי להעריך את הפרמטרים האלקטרופיזיולוגיים, כמתואר בשלבים הבאים.
   1. קבע את זמן ההתאוששות של צומת הסינוס כאורך מחזור ההחזרה המרבי לאחר 10 שניות של קצב קבוע באורך מחזור S1S1 של 120 אלפיות השנייה, 100 אלפיות השנייה ו-80 אלפיות השנייה.
   2. קבע את נקודת Wenckebach כאורך המחזור הארוך ביותר של S1S1 (8 גירויים; S1S1: 100 אלפיות השנייה; הפחתה צעדית של 2 אלפיות השנייה) עם אובדן הולכה של 11 צמתים AV. קבע את תקופות העקשן של הצמתים האטריובנטריקולריים כ-S1S2 הארוכות ביותר (12 גירויים; S1S1: 120 אלפיות השנייה, 110 אלפיות השנייה ו-100 אלפיות השנייה; גירוי נוסף קצר אחד עם הפחתת S1S2 צעד של 2 אלפיות השנייה) עם אובדן הולכת צומת AV.
   3. קבע את תקופות העקשן הפרוזדוריות והחדרים כ-S1S2 הארוך ביותר (12 גירויים; S1S1: 120 אלפיות השנייה, 110 אלפיות השנייה ו-100 אלפיות השנייה; גירוי נוסף קצר אחד עם הפחתת S1S2 צעד של 2 אלפיות השנייה) עם תגובה פרוזדורית או חדרית נעדרת.
2. בצע גירוי נוסף מתוכנת (S1S1: 120 אלפיות השנייה, 100 אלפיות השנייה ו-80 אלפיות השנייה, ואחריו עד 3 פעימות נוספות; 60 - 20 אלפיות השנייה עם הפחתה צעדית של 2 אלפיות השנייה) או פרוטוקולי קצב פרץ (5 שניות ב-S1S1: 50 - 10 אלפיות השנייה עם הפחתה צעדית של 10 אלפיות השנייה) בהתאם למוסכמות למבת' להערכת הפרעת קצב החדרית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נתרן כלורי<	S3014	פתרון קרבס-הנלייט שונה
נתרן מימן-קרבונט	Sigma-Aldrich	401676	פתרון קרבס-הנלייט שונה
אשלגן כלורי	Sigma-Aldrich	P5405	פתרון קרבס-הנלייט שונה
אשלגן פוספט מונו-בסיסי	Sigma-Aldrich	P5655	פתרון קרבס-הנלייט שונה
מגנזיום סולפט heptahydrate	Sigma-Aldrich	M1880	פתרון קרבס-הנלייט שונה
סידן כלורי dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902	פתרון קרבס-הנלייט שונה
Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	פתרון קרבס-הנלייט שונה
נתרן פירובט bioXtra	Sigma-Aldrich	P8574	פתרון קרבס-הנלייט שונה
Carbogen (95% חמצן / 5% פחמן דו חמצני)<		Modified Krebs-Henleit solution
סטרילי מסנן סטרילי-GP 0.22	EMD Millipore	SCGPT05RE	Modified Krebs-Henleit solution
Perfusion system	HUGO SACHS ELEKTRONIK - HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Germany	73-4343	Langendorff apparatus
מערכת רכישת נתונים ותוכנה מתאימה לצנתר ופרמטר פיזיולוגי	Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, New Zealand	PL3508 PowerLab 8/35	Langendorff setup
קטטר אוקטפולרי	CIB'ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USA	מותאם אישית	Langendorff setup
מחולל גירויים	STG4002, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany	STG4002-160μA	הגדרת גירוי
Stimulation software	Multichannel Systems, Reutlingen, Germany	MC_Stimulus II	הגדרת גירוי
Plastic Wrap	Parafilm M, Bemis NA, מבוסס ב-Neenah, WI, ארצות הברית		חומרים מתכלים
מספריים קפיציים	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	15003-08	הכנת לב
מספריים פזילה	Fine Science Tools GmbH, היידלברג, גרמניה	14575-09	הכנת לב
Mayo Scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14110-15	הכנת לב
Dumont SS Forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11203-25	הכנת לב
London Ocps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany<	הכנת לב
Narrow Pattern Ocps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11003-13	הכנת לב

td style='background-color:#ffffff;color:#1a202c;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:middle;'>Sigma-Aldrichtd style='background-color:#ffffff;color:#1a202c;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:middle;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Germanytd style='background-color:#ffffff;color:#1a202c;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:middle;'>11080-02