ניתוח דינמיקת סידן ושינויים פוטנציאליים בממברנה באנדותל עורקי של עכבר

תקציר

מקור: Hakim, M. A. et al., בידוד וניתוח פונקציונלי של אנדותל עורקי של פרנכימה של מוח עכבר. J. Vis. exp. (2022).

סרטון זה מדגים את הניתוח התפקודי של צינור אנדותל עורקי המבודד ממוח עכבר. הוא מתאר את השלבים למדידת רמות הסידן התוך תאי ופוטנציאל הממברנה, הן בנקודת ההתחלה והן בתגובה לגירוי תרופתי.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המתאימה לבעלי חיים.

1. חומרים וציוד

} הערה: ראה את טבלת החומרים עבור כל הריאגנטים והחומרים הנדרשים לפרוטוקול זה. בנוסף, ניתן לעיין גם במדריכים ובאתרים הקשורים לספקים המתאימים לפי הצורך.

1. תא זרימה
   1. הדק תא היתוך עם כיסוי זכוכית על פלטפורמה המורכבת מאלומיניום שעבר אנודייז. אבטח את הפלטפורמה עם החדר על במת מיקרוסקופ אלומיניום.
   2. הגדר מיקרומניפולטור המחזיק פיפטה הצמדה בכל קצה של הפלטפורמה על שלב מיקרוסקופ האלומיניום.
      הערה: במידת הצורך, השתמש במנגנון שלב הניתן להעברה עם יחידת תא זרימה כדי להעביר צינור אנדותל מאובטח ומבודד ממכשיר מיקרוסקופ אחד למשנהו לצורך ניסויים.
2. מיקרוסקופים
   1. הגדר את המנגנון הניסויי על ידי סידור מיקרוסקופ הפוך (מטרות: 4x, 10x, 20x, 40x ו-60x) ושלב אלומיניום ידני על שולחן בידוד רעידות.
3. V_m
   1. חבר את האלקטרומטר לבמה ראשית תואמת. השתמש באביזרים, כגון מחולל פונקציות וממריץ, לפרוטוקולים הדורשים הזרקה נוכחית.
   2. חבר יציאות מגבר למערכת דיגיטייזר נתונים, אוסצילוסקופ וצגי בסיס נשמעים. אבטח את אלקטרודת אמבט הייחוס (גלולת Ag/AgCl) ליד יציאת תא הזרימה.
   3. הרכיבו מערכת פוטומטרית עם רכיבים משולבים של ממשק מערכת פלואורסצנטית, מנורת קשת בעוצמה גבוהה וספק כוח, היפר-מתג, שפופרת מכפיל פוטו (או PMT) ומצלמה למדידת [Ca²⁺]_i בתאי אנדותל.
   4. הרכיבו בקר טמפרטורה המצויד בתנור חימום מוטבע כדי להעלות ולשמור על טמפרטורה פיזיולוגית (37 מעלות צלזיוס) לאורך כל הניסוי.
   5. הרכיבו פלטפורמה רב-ערוצית המחוברת לבקר שסתום עם שסתום בקרת זרימה מוטבע כדי לשלוט באספקת פתרונות לצינורות אנדותל המאובטחים בתא.
4. מיקרופיפטות ואלקטרודות חדות
   } הערה: הנסיין יזדקק למושך זכוכית אלקטרוני ומיקרו-חישול כדי להכין פיפטות סיכה.
   1. כדי לאבטח את צינור האנדותל בתא ההיתוך העל, הכינו פיפטות סיכה מלוטשות בחום עם קצה כדורי קהה (קוטר חיצוני: 50-70 מיקרומטר) שהוכנו מנימי זכוכית בורוסיליקט דקים.
   2. כדי להקליט את ה-V_m של תא אנדותל, הכינו אלקטרודות חדות עם התנגדות קצה של ~150 ±-30 MΩ מנימי זכוכית באמצעות מושך הזכוכית בלבד.

2. תמיסות ותרופות

1. }תמיסת מלח פיזיולוגית (PSS)
   1. הכן מינימום של 1 ליטר PSS באמצעות 140 מ"מ NaCl, 5 מ"מ KCl, 2 מ"מ CaCl₂, 1 מ"מ MgCl₂, 10 מ"מ N-2-הידרוקסיאתילפיפרזין-N'-2-חומצה אתנסולפונית (HEPES), ו-10 מ"מ גלוקוז.
   2. הכנת פתרונות נחוצים חסרי CaCl₂ (אפס Ca²⁺ PSS) לדיסקציה של עורקי המוח ובידוד צינורות אנדותל.
      הערה: הכינו את כל התמיסות ב-H₂{{}}O, ואחריו סינון (0.22 מיקרומטר). ודא שהמוצר הסופי מכיל pH 7.4 עם אוסמולליות בין 290 ל-300 mOsm.
2. Fura-2 וחומרים פרמקולוגיים
   1. הכינו מלאי Fura-2 AM בדימתיל סולפוקסיד (DMSO; 1 מ"מ). הכן 500 מיקרוליטר של ריכוז עבודה (10 מיקרומטר) על ידי הוספת 5 מיקרוליטר מהמלאי ל-495 מיקרוליטר PSS לטעינה.
   2. הכן לפחות 50 מ"ל של ריכוזי עבודה של חומרים פרמקולוגיים ב- PSS או DMSO לפי הצורך.
3. פתרון מוליך
   1. הכן 2 מיליון KCl על ידי המסת KCl ב-H₂O (7.455 גרם של KCl ב-50 מ"ל של H₂O). העבירו את התמיסה דרך מזרק עם פילטר 0.22 מיקרומטר לפני מילוי חוזר של האלקטרודות החדות.

3. ניצול צינורות אנדותל עורקיים לבדיקת פיזיולוגיה תאית

הערה: ניתן להשתמש בצינורות אנדותל עורקיים מבודדים ומאובטחים להקלטות תוך-תאיות של [Ca²⁺]{{}}]_i}דינמיקה ו-V_m באמצעות פוטומטריה ואלקטרופיזיולוגיה של אלקטרודות חדות, בהתאמה, כפי שהודגם קודם לכן ({{}}). [Ca²⁺]_i ו-V_m{{}} ניתן למדוד כמשתני ניסוי נפרדים או משולבים (} איור 1). עם זאת, צינורות אנדותל עורקיים עדינים יותר מאנדותל עורקי, וזמן הניסוי לא יעלה על שעה אחת.

1. {{}}מדידה של [Ca²⁺]_i
   1. הפעל את הציוד והתוכנה עבור הקלטות [Ca²⁺]_i} תוך שמירה על היתוך על רציף בקצב זרימה של 5-7 מ"ל/דקה.
   2. }טען את צינור האנדותל עם ה-Ca²⁺ צבע פורה-2 בבוקר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את התאים בתמיסת סופר-פיוז'ן למשך 20-30 דקות נוספות תוך העלאה הדרגתית של טמפרטורת האמבטיה ל-37 מעלות צלזיוס. שמרו על הטמפרטורה על 37 מעלות צלזיוס לאורך כל הניסוי.
   3. כוונן ידנית את חלון ההדמיה באמצעות תוכנת פוטומטריה כדי להתמקד ב~20 תאי אנדותל ( איור 1A). בהיעדר אור, הפעל את ה-PMT בממשק הקרינה והתחל לרכוש את [Ca²⁺]_i על ידי גירוש Fura-2 לסירוגין (≥10 הרץ) ב-340 ננומטר ו-380 ננומטר תוך איסוף פליטת הקרינה ב-510 ננומטר. לאחר שנוצרה הקלטה בסיסית יציבה של [Ca²⁺]_i}, השתמשו בחומרים פרמקולוגיים (למשל, אגוניסטים לקולטנים פורינרגיים) לפי מטרת הניסוי (} איור 1B).
2. מדידת V_m
   1. } הפעל את הציוד והתוכנה עבור הקלטות V_m} והגדר את קצב איסוף הנתונים (≥10 הרץ) תוך שמירה על היתוך על רציף בקצב זרימה של 5-7 מ"ל/דקה. העלו בהדרגה את טמפרטורת האמבטיה ל-37 מעלות צלזיוס ושמרו עליה עד סוף הניסוי.
   2. משוך אלקטרודה חדה באמצעות נימי זכוכית בורוסיליקט, מילוי חוזר עם 2 M KCl, ואבטח אותה מעל חוט כסף מצופה כלוריד במחזיק הפיפטה המחובר לאלקטרומטר שבתורו מוחזק על ידי מיקרומניפולטור.
   3. תוך כדי צפייה דרך המטרה 4x, השתמש במיקרומניפולטור כדי למקם בזהירות את קצה האלקטרודה החדה ממש מעל תא של צינור האנדותל העורקי לתוך ה-PSS הזורם בתא.
   4. הגדל בהדרגה את ההגדלה ל-400x ומקם מחדש את קצה האלקטרודה לפי הצורך.
   5. בעזרת המיקרומניפולטור, הכניסו בעדינות קצה של אלקטרודה חדה לתוך אחד התאים של צינור האנדותל והתחילו להקליט V_m באמצעות אלקטרומטר (}איור 1A).

ברגע שהאנדותל במנוחה V_m יציב (−30 עד −40 mV), יש ליישם את החומרים הפרמקולוגיים הרצויים לכל יעד ניסוי (} איור 1C).

תוצאות

איור 1: יישום צינור אנדותל לבדיקה פיזיולוגית של מסלולים הקשורים לוויסות זרימת הדם. (A) אלקטרודה חדה (חץ סגול) ממוקמת בתא של צינור אנדותל הממוקד בחלון רכישת הנתונים לפוטומטריה. (B) הקלטה מייצגת של Ca²⁺ באמצעות פוטומטריית Fura-2 בתגובה ל-MTA (1 מיקרומטר). (C) הקלטה מייצגת של V_m בו-זמנית עם עקבות Ca²⁺ בחלונית B

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Amplifiers	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
צגי בסיס Audible	Ampol US LLC, סרסוטה, פלורידה, ארה"ב	BM-A-TM
צ'ילר אמבטיה (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
נימי זכוכית בורוסיליקט (הצמדה)	Warner Instruments	G150T-6
נימי זכוכית בורוסיליקט (אלקטרודות חדות)	Warner Instruments	GC100F-10
BSA: סרום בקר אלבומין	סיגמא	A7906
CaCl2: Calcium Chloride	Sigma	223506
DMSO: Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D8418
שסתום בקרת זרימה	Warner Instruments	FR-50
ממשק מערכת פלואורסצנטי, מנורת ARC וספק כוח, היפר-מתג	והתקנים מולקולריים PMT, סאניווייל, קליפורניה, ארה"ב	IonOptix Systems
מחולל פונקציות	EZ Digital, סיאול, דרום קוריאה	FG-8002
Fura-2 AM dye	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F14185
גלוקוז	Sigma-Aldrich (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)	G7021
HCl: חומצה הידרוכלורית	ThermoFisher Scientific (פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב)	A466250
Headstages	Molecular Devices	HS-2A & HS-9A
HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)	Sigma	H4034
inline solution heater	Warner Instruments	SH-27B
KCl: אשלגן כלורי	סיגמא	P9541
MgCl2: מגנזיום כלוריד	סיגמא	M2670
Microforge	Narishige, East Meadow, NY, ארה"ב	MF-900
Micromanipulator	Siskiyou	MX10
חולץ מיקרופיפטה (דיגיטלי)	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97 או P-1000
מיקרוסקופ (הפוך)	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA	Ts2
מיקרוסקופ ( Nikon-inverted)	Nikon Instruments Inc	Eclipse TS100
מטרות מיקרוסקופ	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor) ו-40X (Plan Fluor)
, 7.8 ס"מ)	Warner Instruments	PM6 או PH6
שלב מיקרוסקופ (אלומיניום)	Siskiyou, Grants Pass, OR, ארה"ב	8090P
MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate מלח טריסודיום	Tocris	1624
NaCl: Sodium Chloride	Sigma	S7653
NaOH: נתרן הידרוקסיד	Sigma	S8045
אוסצילוסקופ	Tektronix, ביברטון, אורגון, ארה"ב	TDS 2024B
'יעדי ניגודיות פאזה	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X & 20X)
תא סופר-פיוז'ן פרספקס	וורנר אינסטרומנטס, קמדן, קונטיקט, ארה"ב	RC-27
סטריאומיקרוסקופים	Zeiss, NY, ארה"ב	Stemi 2000 & 2000-C
מסנן מזרק (0.22 מיקרומטר)	ThermoFisher Scientific	722-2520
בקר טמפרטורה (ערוץ כפול)	Warner Instruments	TC-344B או C
מערכת בקרת שסתומים	Warner Instruments	VC-6
ייצור טכני של שולחן בידוד רעידות	, פיבודי, MA, ארה"ב	מיקרו-גרם