הערכת רמות נוירוטרנסמיטורים מעוררים בחולדות הנגרמות על ידי אפילפסיה כרונית

תקציר

מקור: Soukupová, M., et al. מיקרודיאליזה של חומצות אמינו מעוררות במהלך רישומי EEG בחולדות הנעות בחופשיות. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים את ההערכה של רמות נוירוטרנסמיטורים מעוררים חוץ-תאיים בחולדות עם השראת אפילפסיה כרונית. לאחר השתלת בדיקת מיקרודיאליזה במוח ואישור היעדר התקפים באמצעות אלקטרואנצפלוגרפיה (EEG), נאסף נוזל חוץ-תאי כדי להעריך רמות נוירוטרנסמיטורים גבוהות בחולדות אפילפטיות. לאחר מכן מוזרקת תמיסה עתירת אשלגן כדי לשמור על ריגוש עצבי ולעורר שחרור מוגבר של נוירוטרנסמיטורים, כאשר דגימות נאספות כדי להעריך את השיא המושרה על ידי אשלגן בנוירוטרנסמיטורים מעוררים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים וועדת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

פרוטוקול זה מותאם במיוחד לקביעת גלוטמט ואספרטט בדיאליזה במוח של חולדות המתקבלות תחת בקרת EEG של מפגשי מיקרודיאליזה בחולדות אפילפטיות ולא אפילפטיות. רבים מהחומרים המתוארים כאן יכולים להיות מוחלפים בקלות באלה שמשתמשים בהם במעבדה שלו להקלטות EEG או מיקרודיאליזה.

1. הרכבה של מכשיר האלקטרודה לבדיקת מיקרודיאליזה

1. השתמש באלקטרודה דו-מפותלת בעלת 3 ערוצים (עם אורך חיתוך של לפחות 20 מ"מ של אלקטרודת הרישום ואלקטרודת הארקה באורך 10 ס"מ) והצמד אותה לצינורית מנחה להכנת המכשיר. ראה דוגמאות לאלקטרודה תלת-ערוצית וצינורית מנחה לדיאליזה באיור 1A-1B.
2. הסר (איור 1C) והכנס (איור 1D) את צינורית מוביל המתכת לתוך צינורית הפלסטיק הדמה כמה פעמים לפני השימוש כדי להקל על הסרתה ברגע המעבר שלה לבדיקת מיקרודיאליזה בבעלי חיים.
3. כופפו את החוטים המעוותים של אלקטרודת הרישום פעמיים (איור 1E-1F) כדי ליישר את החוטים עם צינורית הדמה של המכוון וחתכו את קצה האלקטרודה (איור 1G) כך שיהיה ארוך ב-0.5 מ"מ מקצה צינורית ההנחיה (איור 1H) באמצעות הקליפר הדיגיטלי.
4. הכינו את עיגול הסיליקון באורך 1 מ"מ (OD 2 מ"מ, עובי 0.3 מ"מ; איור 1I) והכניסו את קצה צינורית ההנחיה ואת קצה האלקטרודות המעוותות לתוך עיגול הסיליקון באמצעות הפינצטה (איור 1J). קבע אותו על כף הרגל של הדום של צינורית ההנחיה עם דבק פולימרי בעל פעולה מהירה או שרף (איור 1K). ראה את הדוגמה של ההתקנים שהושלמו באיור 1L ובאיור 2A.
5. עקר את המכשיר תחת אור UV קוטל חיידקים למשך 4 שעות. הפוך את המכשיר ארבע פעמים כך שכל אחד מהצדדים שלו חשוף לאור למשך שעה < / >הערה: אלקטרודות תוצרת בית רבות ובדיקות מיקרודיאליזה עשויות להיות מורכבות בצורה דומה. לראש השתל המתואר לעיל לחולדות יש את הממדים הבאים: רוחב 7 מ"מ x 5 מ"מ עומק x 10 מ"מ אורך מלמעלה לבוהן הכן; קצה השתל הוא באורך של כ-11 מ"מ, קוטרו 600 מיקרומטר וכל משקל המכשיר כ-330-360 מ"ג. ניתן לעשות שימוש חוזר במכשיר פעמיים או שלוש אם (1) אורך מספיק של האלקטרודה הקרקעית נותר על הגולגולת במהלך הניתוח לשימוש הבא ו-(2) כאשר בעל החיים נהרג, והמכשיר משוחזר יחד עם המלט הדנטלי הוא נשאר באצטון למשך הלילה, כך שניתן יהיה לפרק את המלט באופן מכני, והמכשיר נשטף ועוקר שוב.

2. ניתוח סטריאוטקסי

1. השתמש במנגנון סטריאוטקסי ובמחזיק קליפ בדיקה (איור 2B) להשתלת המכשיר בהתאם לסטנדרטים העכשוויים לניתוחים אספטיים וללא כאבים.
   1. הרדמו את חולדות ספראג-דולי הבוגרות בתערובת קטמין/קסילזין (43 מ"ג/ק"ג ו-7 מ"ג/ק"ג, i.p.) וקבעו אותה על המסגרת הסטריאוטקסית. הוסף הרדמה איזופלורן (1.4% באוויר; 1.2 מ"ל/דקה) להזרקה ראשונית של קטמין/קסילזין מכיוון שהיא מאפשרת לשלוט בעומק ההרדמה בזמן. לגלח את הפרווה על ראש החיה.
2. ספוג את פני העור של הראש בתמיסה מבוססת יוד ואחריה 70% אתנול כדי להכין אותו לניתוח אספטי.
   1. השתל את מכשיר האלקטרודה המנחה שהוכן בקדימות (1.1 - 1.5) בהיפוקמפוס הגחוני הימני באמצעות הקואורדינטות הבאות: מוט האף + 5.0 מ"מ, A - 3.4 מ"מ, L + 4.5 מ"מ, P + 6.5 מ"מ לברגמה. עקוב אחר הטכניקות הסטנדרטיות לניתוחים סטריאוטקסיים.
   2. ודא שהוא אינו מכסה את ברגי העיגון. בעת הרכבתו על המנגנון הסטריאוטקסי, אחוז במכשיר עבור ראש צינורית ההנחיה מכיוון שניתן ליישר אותו בקלות למחזיק הבדיקה.
3. עוגן את המכשיר לגולגולת עם לפחות ארבעה ברגי אל חלד המבריגים אותם לתוך עצם הגולגולת (בורג אחד לשמאל ובורג אחד לתוך לוחות העצם הקדמיים הימניים, בורג אחד לקודקוד השמאלי ובורג אחד לתוך לוחות העצם הבין-קודקודיים). הוסף טיפה של דבק רקמות כדי לקבע עוד יותר כל בורג לעצם הגולגולת.
   1. מכסים מחצית מחוטי הברגים במלט מתאקרילי. קדם את קשירת המלט על ידי יצירת חריצים רדודים בעצם כדי להגביר את ההדבקה.
4. לאחר שקצה המכשיר ממוקם ברקמת המוח, סובב את חוט האלקטרודה ההארקה סביב 3 ברגי עיגון. כסו את כל הברגים המותקנים ואת המכשיר במלט הדנטלי.
5. עקוב אחר בעלי החיים במהלך הניתוח ובמשך כשעה לאחר מכן עד שהם זקופים ומסתובבים בכלוב. שמור אותם על כרית חימום כדי למנוע היפותרמיה. אפשר לחולדות להתאושש לפחות 7 ימים לאחר השתלת המכשיר.
6. יש לעקוב אחר בעלי החיים לפחות פעם ביום במשך 3 ימים לאחר הניתוח לאיתור סימני כאב או מצוקה. תנו לבעלי החיים את הקרם האנטיביוטי (גנטמיצין 0.1%) קרוב למקום החתך כדי למנוע את הזיהום ומשכך כאבים (טרמדול 5 מ"ג/ק"ג, תוך-צפק) למשך 3 ימים כדי למנוע את הכאב שלאחר הניתוח.

3. השראת אפילפסיה של האונה הרקתית על ידי פילוקרפין והקצאת בעלי חיים לקבוצות ניסוי

1. לאחר שבוע של התאוששות לאחר הניתוח, הקצו את החיות באופן אקראי לקבוצות: (i) חיות ביקורת המקבלות רכב ו-(ii) חיות אפילפטיות שיקבלו פילוקרפין. השתמש במספר גבוה יותר של בעלי חיים לקבוצה אפילפטית מכיוון שלא כל החולדות הניתנות לפילוקרפין יפתחו את המחלה.
2. יש להזריק מנה של מתילסקופולמין (1 מ"ג/ק"ג, תת עורי [s.c.]) ו-30 דקות לאחר מכן, זריקה אחת של פילוקרפין (350 מ"ג/ק"ג, i.p.) כדי לגרום לסטטוס אפילפטיקוס (SE). הזרקת מתילסקופולמין והרכב (מי מלח) לחולדות הביקורת. השתמש במזרק 1 מ"ל עם מחט 25G לכל הנהלות i.p.
   1. בדוק ויזואלית את החיות כדי להתחיל לחוות התקפים התנהגותיים (הזזת ויבריסה תוך 5 דקות, הנהון ראש, שיבוט הגפיים) ותוך 25 דקות לשכפל באופן רציף את כל הגוף (SE).
3. יש לעצור את ה-SE שעתיים לאחר הופעת המחלה כדי שתהיה תמותה של כ-25% ותקופה סמויה ממוצעת של כ-10 ימים על ידי מתן דיאזפם (20 מ"ג/ק"ג, i.p). התבונן ורשום כל התנהגות התקפים החל מיד לאחר הזרקת הפילוקרפין והמשך לפחות 6 שעות לאחר מכן.
4. תן לבעלי החיים תמיסת מלח (1 מ"ל, i.p.) באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 25G ותמיסת סוכרוז (1 מ"ל, לכל מערכת [p.o.]) באמצעות מזרק 1 מ"ל ומחט האכלה גמישה של 17G למשך 2-3 ימים לאחר SE כדי לקדם את ההתאוששות של הירידה במשקל הגוף.
   1. אל תכלול במחקר את החיות שלא הגיעו למשקל הגוף ההתחלתי בשבוע הראשון לאחר PILOCARPINE SE (למעט הקבוצה החריפה שנהרגה 24 שעות לאחר SE, שם מעקב אחר משקל הגוף אינו אפשרי).
5. הקצו חיות לאחר SE באופן אקראי לקבוצות ניסוי שונות (איור 3): שלב אקוטי (שבו המיקרודיאליזה מתרחשת 24 שעות לאחר SE), חביון (7-9 ימים לאחר SE), התקף ספונטני ראשון (כ-11 ימים לאחר SE), ומחזור כרוני (מתחיל כ-22-24 ימים לאחר SE, כלומר כ-10 ימים לאחר ההתקף הראשון). עקוב אחר בעלי החיים להופעת התקפים ספונטניים.
   הערה: השתמש בקריטריוני ההכללה/אי הכללה הבאים לניסויים נוספים בחולדות אפילפטיות: התפתחות SE עוויתי תוך שעה אחת לאחר מתן פילוקרפין; עלייה במשקל בשבוע הראשון לאחר SE והמיקום הנכון של בדיקת המיקרודיאליזה והאלקטרודה.

4. ניטור וניתוח התנהגות אפילפטית

1. ניטור ארוך טווח של התנהגות אפילפטית
   1. כ-6 שעות לאחר מתן פילוקרפין (כלומר, בתום תצפית ישירה על ידי החוקרים), הכניסו את החיות לכלובים הביתיים הנקיים והתחילו בניטור וידאו של 24 שעות.
   2. המשך בניטור וידאו 24 שעות ביממה עד היום החמישי, באמצעות מערכת מעקב וידאו דיגיטלית.
   3. החל מהיום החמישי, חברו את החולדות בכלובים המלבניים הביתיים שלהן למערכת הקלטת EEG קשורה והמשיכו בניטור וידאו 24 שעות ביממה.
   4. הגדר את הפרמטרים על המגבר הממוקם מחוץ לכלוב פאראדיי (הגדר את גורם ההגברה בכל ערוץ בהתאם לספציפיות של אות ה-EEG של כל חיה בודדת) והתחל את רכישת ה-EEG תוך התבוננות באות ה-EEG המופק על ידי כבלים לא מחוברים. השתמש בקצב דגימה של 200 הרץ ומסנן מעבר נמוך מוגדר ל-0.5 הרץ.
   5. חבר את החיה לכבלים המחזיקים ראש של בעל חיים בין שתי אצבעות מתוחות של יד אחת ומבריגים את המחברים אל הדום האלקטרודה באמצעות היד החופשית השנייה. התחל את הרכישה.
      זהירות: ודא שהאות נקי מחפצים. חפצים נפוצים הם הקוצים העולים בהרבה על קנה המידה.
   6. יום לפני ניסוי המיקרודיאליזה, העבירו את החיות למערכת EEG קשורה המצוידת בגלילי פרספקס למיקרודיאליזה. נתק את החיות ממערכת קשירת ה-EEG בכלוב הביתי והברג את המחברים מהאלקטרודה מבלי לרסן את החיה. הנח את החיה בגלילי הפרספקס הגבוהים.
2. ניטור התנהגות אפילפטית יום לפני ובמהלך מפגש המיקרודיאליזה
   1. הפעל את המגבר הממוקם מחוץ לכלוב פאראדיי. פתח את תוכנת ה-EEG. התחל את רכישת ה-EEG על ידי התבוננות באות ה-EEG המופק על ידי כבלים לא מחוברים.
   2. חבר את החיה למערכת הקלטת EEG קשורה, החזק ראש של בעל חיים בין שתי אצבעות מתוחות של יד אחת והברג את המחברים אל כן האלקטרודה באמצעות היד החופשית השנייה. הגדר גורם הגברה (הגבר) בכל ערוץ של מגבר בהתאם לאות האלקטרודה של חיה בודדת כך שאות ה-EEG יהיה בקנה מידה. תנו לחיה לחקור את הכלוב החדש (גליל) למשך שעה אחת לפחות תחת השגחה ישירה של החוקר.
   3. הערה: 24 שעות לפני ניסוי המיקרודיאליזה, החולדות מורדמות לזמן קצר עם איזופלורן להחלפת צינוריות ההנחיה לבדיקת מיקרודיאליזה. נצל את הרגע שבו הם מורדמים כדי לחבר אותם למערכת ההקלטה EEG.
   4. קצר או האריך את כבל המטוטלת בהתאם לסחורה של החיה. ודא שהכבלים אינם מפריעים לתנועות החיה ולתנוחת השכיבה.
   5. בדוק את מסגור התמונה הנכון של מצלמות הווידאו. התחל את הקלטת הווידאו-EEG.
3. זיהוי התקפים ופעילות EEG
   1. השתמש בנגן תוכנה כדי לצפות בסרטונים. גלול את הסרט פי 8 מהר יותר מהמשחק בזמן אמת והבחין בהתקפים הכלליים (ראה בעל חיים לאחור עם קלונוס גפיים קדמיות או גידול בעלי חיים ונפילה עם קלונוס גפיים קדמיות). האטו את הסרטון ושימו לב לזמן המדויק של תחילת וסיום ההתקף ההתנהגותי.
   2. לעבד את הנתונים על ידי ספירת מספר ההתקפים הכלליים שנצפו ב-24 שעות של רשומות וידאו ולבטא אותם במונחים של תדירות ומשך ההתקפים כערכים ממוצעים של כל ההתקפים שנצפו ב-24 שעות.
   3. הגדירו את התקפי ה-EEG כתקופות של פעילות פרוקסימלית בתדר גבוה (>5 הרץ) המאופיינות בתוספת משרעת של פי >3 על פני קו הבסיס עם התקדמות תדר הספייק שנמשכת לפחות 3 שניות או דומה. השתמש בתוכנת EEG כדי לעבד את הקלטות ה-EEG הגולמיות. פצל את עקבות ה-EEG לשברים של שעה. העתק את שברי המעקב של EEG לקובץ לניתוח ספייק אוטומטי של תוכנה.
   4. לנתח את נתוני פעילות ה-EEG באמצעות תוכנת EEG ופרמטרים מוגדרים מראש (4.3.3). בצע את כל ניתוחי הווידאו בשני חוקרים עצמאיים העיוורים לקבוצת החיות שנותחו. במקרה של סטייה, גרום להם לבחון מחדש את הנתונים יחד כדי להגיע להסכמה.

5. מיקרודיאליזה

1. התאוששות בדיקה במבחנה
   1. הכן את הגשושית לשימוש הראשון שלה על פי הוראות היצרן, וטפל בה בשרוול המגן שלה.
   2. הפעל את הניסוי בשלוש עותקים: הכינו שלוש מבחנות של 1.5 מ"ל והעמיסו עליהן 1 מ"ל של תמיסת רינגר המכילה את תערובת התקנים (2.5 מיקרומטר גלוטמט ו-2.5 מיקרומטר אספרטט). הכניסו שלוש מבחנות טעונות של 1.5 מ"ל למחמם הבלוק המוגדר ל-37 מעלות צלזיוס והניחו אותו על המערבל.
      הערה: השתמש באותם פתרונות סטנדרטיים לכיול כרומטוגרפיה.
   3. אטמו את המבחנות בנפח 1.5 מ"ל בסרט פרפין ונקבו אותו בפינצטה חדה כדי ליצור חור בקוטר של כ -1 מ"מ.
   4. קח את הגשושית והכנס אותה לחור שנעשה בסרט פרפין. טבלו את הממברנה לפחות 2 מ"מ מתחת לרמת התמיסה. קבע עוד יותר את הגשושית למבחנה של 1.5 מ"ל על ידי סרט פרפין.
      זהירות: ודא שהקצה אינו נוגע בדפנות המבחנה בנפח 1.5 מ"ל.
   5. חבר את כניסת הבדיקה למזרק המותקן על משאבת העירוי באמצעות אתילן פרופילן מופלר (FEP) - מתאמי צינורות וצינורות. לחלופין, השתמש בצינורות פוליאתן עדינים בקוטר פנימי (ID) של 0.28 מ"מ וקוטר חיצוני של 0.61 מ"מ (OD) ובמתאמי צינורות צבעוניים (מתאמי צינורות אדומים וכחולים) לחיבורים.
   6. הפעל את המשאבה ב-2 מיקרוליטר לדקה ותן לנוזל להופיע בקצה היציאה. חבר את שקע הבדיקה למבחנת האיסוף של 0.2 מ"ל באמצעות מתאמי צינורות וצינורות FEP.
      הערה: השתמש בצינורות FEP עבור כל החיבורים. חתוך את אורך הצינור הרצוי באמצעות סכין גילוח. השתמש במתאמי צינורות בצבע שונה לכניסה ויציאה של הגשושית. תן למשאבה לפעול במשך 60 דקות. בדוק אם יש נזילות ובועות אוויר. אלה לא צריכים להיות קיימים.
   7. הגדר את המשאבה לקצב הזרימה של 2 מיקרוליטר לדקה והתחל לאסוף את הדגימות בצד היציאה של הצינור.
   8. אסוף שלוש דגימות פרפוזה של 30 דקות ושלוש דגימות בנפח שווה של התמיסה במבחנה של 1.5 מ"ל. קח את הדגימות בנפח שווה מהמבחנה של 1.5 מ"ל כל 30 דקות באמצעות המיקרו-מזרק השקוע בתמיסה הסטנדרטית במבחנה של 1.5 מ"ל.
   9. חזור על הניסוי (5.1.1-5.1.8) והגדרת המשאבה לקצב הזרימה של 3 מיקרוליטר לדקה (5.1.7) כדי לבצע השוואת התאוששות בדיקה בעת שימוש בשני קצבי זרימת זלוף שונים.
   10. בסיום, עצרו את המשאבה ושטפו את הצינור במים מזוקקים, 70% אתנול ודחפו את האוויר לתוכה. אחסן את הגשושית בבקבוקון מלא במים מזוקקים נקיים. שטפו היטב את הגשושית על ידי החדרתה בטמפרטורה של 2 מיקרוליטר לדקה במים מזוקקים לפני האחסון.
   11. לנתח את ריכוז הגלוטמט והאספרטט בדגימות על ידי כרומטוגרפיה.
   12. חשב את ההתאוששות באמצעות המשוואה הבאה:
       התאוששות (%) = (C_perfusate /C_{תמיסת דיאליזה}) x 100.
2. מפגשי מיקרודיאליזה בחולדות הנעות בחופשיות
   1. הליכי הכנה: החדרה ובדיקה של בדיקה, הגדרת משאבת עירוי והתחלה
      1. הכן את בדיקות המיקרודיאליזה לשימוש הראשון על פי מדריך המשתמש של היצרן ומלא אותן בתמיסה של רינגר. חותכים חתיכות באורך של כ-10 ס"מ של צינורות FEP ומחברים אותן לצינוריות כניסה ויציאה של הגשושית באמצעות מתאמי הצינורות בצבעים שונים.
      2. ודא שהצינור נוגע במתאמים ללא שטח מת בכל החיבורים.
      3. 24 שעות לפני ניסוי המיקרודיאליזה, יש להרדים לזמן קצר את בעל החיים עם איזופלורן (5% באוויר) בתא אינדוקציה עד לשכיבה. הסר את צינורית הדמה מהמדריך שלה באמצעות הפינצטה והחזק את ראש החיה בחוזקה. הכנס את בדיקת המיקרודיאליזה, הניחנת בקרום דיאליזה, לתוך צינורית ההנחיה ומצק עוד יותר את צינוריות המיקרודיאליזה המוכנסות למדריך שלהן על ידי דוגמנות חימר.
         זהירות: אל תתנו לבדיקה לגעת בדפנות שרוול הבדיקה המגן בעת החילוץ.
      4. הכניסו את החיה לגליל הפרספקס ותנו לה לחקור את האווירה החדשה. חבר את החיה למערכת הקלטת EEG קשורה כמתואר לעיל (עקוב אחר הנקודות 4.2.2 ו-4.2.3).
      5. עקוב אחר תנועות החולדה הערות והנעות בחופשיות וחבר את כניסת הגשושית למזרק 2.5 מ"ל עם מחט קהה של 22G המכילה את הפתרון של רינגר באמצעות מתאמי הצינורות. דחוף את התמיסה של רינגר בתוך הגשושית ופולט 1 מ"ל של התמיסה של רינגר תוך 10 שניות ודוחף ברציפות את הבוכנה של מזרק 2.5 מ"ל. בדוק אם טיפת הנוזל מופיעה על השקע. הגשושית מוכנה כעת לשימוש.
      6. מלאו את מזרקי ה-2.5 מ"ל המחוברים לצינורות FEP על ידי מתאמי צינורות בתמיסה של רינגר והרכיבו אותם על משאבת העירוי. הפעל את המשאבה ב-2 מיקרוליטר לדקה. תן לזה לרוץ בן לילה.
         הערה: השתמש באורך הרצוי של כל צינורות ה-FEP אך חשב את נפח הצינור המת כדי לדעת מתי יש להתחיל את גירוי ה-K⁺ הגבוה וכדי לתאם את נתוני הכימות עם שינויים נוירוכימיים במוח החיה. השתמש בבועת האוויר שנוצרה בצינור מתחת לזרימת העבודה כדי לחשב את הזמן הזה.
   2. איסוף דגימות במהלך רישום EEG וגירוי אשלגן
      1. ודא את היעדר ההתקפים ב-3 השעות שקדמו לתחילת איסוף הדגימות (הקלטות וידאו-EEG) והמשך לעקוב אחר פעילות ההתקפים במהלך מיקרודיאליזה.
      2. עצור את המשאבה הנושאת את צינורות ה-FEP המזרקים המשופעים מלאים בתמיסה של רינגר. התקן על המשאבה סט נוסף של מזרקים של 2.5 מ"ל המחוברים לצינורות FEP עם מתאמי צינורות מלאים בתמיסת רינגר שונה המכילה תמיסת 100 מ"מ K⁺.
      3. הפעל את המשאבה ב-2 מיקרוליטר לדקה ותן לה לפעול. למילוי מהיר יותר של הצינור, הגדר את המשאבה על 5 מיקרוליטר לדקה למשך זמן המילוי. בדוק אם אין בועות אוויר במערכת. ודא שהצינור נוגע במתאמים ללא שטח מת בכל החיבורים.
      4. בדוק את הגשושית אם היא מוכנה לשימוש בבעלי חיים כמתואר לעיל (5.2.1.5).
      5. הערה: אם מסיבה כלשהי הגשושית לא עובדת, שנה אותה. במקרים אלה, שמור כמה בדיקות מיקרודיאליזה מוכנות לשימוש ליד תחנת העבודה של מיקרודיאליזה-EEG. נתק את החיה מכבלי EEG והרדים אותה לזמן קצר עם איזופלורן במידת הצורך כדי לממש את השינוי.
      6. חבר את צינורות ה-FEP של מזרקים מלאים בתמיסת רינגר לצינורית הכניסה של הגשושית בכל בעל חיים והמתן להופעת טיפת הנוזל בקצה השקע.
      7. חבר את שקע הגשושית לצינור ה- FEP, מה שמוביל לאיסוף במבחנה. הכנס את צינור ה-FEP למבחנה הסגורה של 0.2 מ"ל עם מכסה מחורר. ודא שהצינור נשאר במקום על ידי קיבוע עם חתיכת חימר דוגמנות.
      8. המשך להפעיל את המשאבה ב-2 מיקרוליטר לדקה למשך 60 דקות מבלי לאסוף דגימות כדי לאזן את המערכת (אפס דגימה).
      9. אסוף 5 דגימות דיאליזה רצופות של 30 דקות (נפח 60 מיקרוליטר בהתאמה) בתנאי בסיס (זלוף עם תמיסת רינגר רגילה). אחסן דוגמאות על קרח.
      10. חשב את הזמן שלוקח לנוזל לעבור מהמשאבה לראש החיה (זה תלוי בנפח המת של הצינור, כלומר, זמן בועת האוויר) והחלף את צינורות ה-FEP שעוברים מהמזרקים המכילים תמיסת רינגר רגילה למזרקים המכילים תמיסת רינגר שונה (100 מ"מ K⁺) בשלב זה מבלי לעצור את המשאבה. בדוק אם אין בועות אוויר במערכת. תן למשאבה לפעול במשך 10 דקות. זהירות: ב-10 דקות של גירוי K⁺ גבוה, בעלי החיים נוטים להזיז את עצמם בטירוף ובדרך כלל מציגים מספר רב של טלטולי כלבים רטובים (חיות אשכול התקפים) או התקפים התנהגותיים (בעלי חיים אפילפטיים), אז היו מוכנים להתערב כדי להגן על הצינורות והכבלים מפני פיתול.
      11. לאחר 10 דקות, החלף את הצינור מהמזרקים המכילים 100 מ"מ K⁺ תמיסת רינגר לתמיסת רינגר רגילה ותן למשאבה לפעול. אל תכבה את המשאבה במהלך החלפת התמיסה כך שתהיה טיפה של הנוזל בקצה הצינור שיחובר בשורה.
      12. מהרגע בו הדיאליזה מכילה אשלגן גבוה, כלומר לאחר איסוף הדיאליזה החמישית לאחר שיווי המשקל, אסוף את שברי הדיאליזה כל 10 דקות (20 מיקרוליטר) למשך שעה. אסוף 3 דגימות דיאליזה נוספות של 30 דקות ועצור את המשאבה. אחסן את הדגימות על קרח.
      13. אחסן את הדגימות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לאחר הניסוי עד לניתוח כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC).
      14. חזור על ניסוי המיקרודיאליזה במשך 3 ימים רצופים, למעט קבוצת ההתקף החריף (24 שעות) וההתקף הראשון, שבה רק מפגש מיקרודיאליזה אחד מתרחש 24 שעות לאחר SE או תוך 24 שעות לאחר ההתקף הספונטני הראשון (איור 3).

תוצאות

איור 1. הכנה שלב אחר שלב של המכשיר המיועד להשתלה. (A) אלקטרודה תלת-ערוצית עם אלקטרודת הארקה באורך 10 ס"מ בשרוול המגן שלה משמאל וצינורית מנחה למיקרודיאליזה מימין הדרושה להרכבת המכשיר. (B). האלקטרודה החשופה וצינורית ההנחיה בפירוט. השלב הראשון הוא להסיר...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
3-3-channel two-twisted electrode	Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA	MS333/3-B/SPC	Material
צינורית מדריך	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	MAB 4.15.IC	Material
Resin KK2 Plastik	Elettra Sport, Lecco, Italy	KK2	Material
Super Attack gel Loctite	Henkel Italia Srl, Milano, Italy	2047420_71941	Material
Imalgene-Ketamine	Merial, טולוז, צרפת	221300288 (AIC)	Solution
Xylazine	Sigma, Milano, Italy	X1251	Material
Isoflurane-Vet	Merial, טולוז, צרפת	103120022 (AIC)	Solution
Altadol 50 מ"ג/מ"ל - tramadol	Formevet, מילאנו, איטליה	103703017 (AIC)	Solution
Gentalyn 0.1% crm - gentamycine	MSD Italia, רומא, איטליה	20891077 (AIC)	חומר
סימפלקס צמנט דנטלי מהיר	Kemdent, Associated Dental Products Ltd, סווינדון, בריטניה	ACR811	Material
GlasIonomer CX-Plus Cement	Shofu, Kyoto, Japan	PN1167	Material
'מחזיק קליפ בדיקה	Agn Tho's, Lindigö, שוודיה	p/n 100 5001	ציוד
Histoacryl® כחול דבק עור מקומי	TissueSeal, אן ארבור, מישיגן, ארה"ב	TS1050044FP	חומר
ואליום 10 מ"ג/2 מ"ל - diazepam	Roche, מונזה, איטליה	019995063 (AIC)	Material
1 מ"ל מזרק עם מחט 25G	Vetrotecnica, Padova, Italy	3	Material
מחט האכלה גמישה לחולדה 17G	Agn Tho's, Lindigö Sweden	7206	Material
Grass Technology apparatus	Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA		M665G08 Equipment (מגבר AS40, תיבת ראש, כבלים מחברים, דגם טלגורם RPSA S40)
מערכת איסוף וניתוח נתונים מודולרית MP150	ביופאק, גולטה, קליפורניה, ארה"ב	MP150WSW	ציוד
	AverMedia Technologies, פרמונט, קליפורניה, ארה"ב	V4.7.0041FD	ציוד
	Agn Tho's, Lindigö שוודיה	MAB 4.15.1.Cu	Material
בדיקת מיקרודיאליזה	Synaptech, קולורדו ספרינגס, קולורדו, ארה"ב	S-8010	חומר
	Grant Instruments, קיימברידג', אנגליה	QBD2	ציוד
stirrer	Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy	711	Equipment
משאבת עירוי	Univentor, Zejtun, מלטה	864	Equipment
צינורות פוליאתן עדינים	Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA	800/100/100/100	Material
מתאמי צינורות כחולים	Agn Tho's, Lindigö Sweden	1002	Material
'מתאמי צינורות אדומים	Agn Tho's, Lindigö Sweden	1003	Material
2.5 מ"ל מזרק עם מחט 22G	Chemil, Padova, איטליה	S02G22	Material
כובע בקבוקון	Cronus, Labicom, Olomouc, צ'כיה	VCA-1004TB-100	Material
septum	Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA	National C4013-60 8 מ"מ TEF/SIL septum	חומר
'תוספת זכוכית עם קפיץ תחתון	Supelco, Sigma, Milano, איטליה	27400-U	חומר
autosampler National	Scientific, Thermo Fisher Scientific, מונזה, איטליה	C4013-2	חומר
Smartline manager 5000 בקר מערכת ויחידת מסיר גז	Knauer, ברלין, גרמניה	V7602	Equipment
Smartline 1000 משאבת שיפוע רבעונית	Knauer, ברלין, גרמניה	V7603	Equipment
הרכב תמיסת רינגר	במ"מ: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA		Solution
	M: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA		Solution
מלח	0.9% NaCl, pH מותאם ל-7.0		Solution
	10% סוכרוז בתמיסת מים

מזוקקים