תיוג חיסוני של חלבוני ממברנה עצבית בדגימה שסועה בהקפאה של רקמת מוח של עכבר

תקציר

מקור: Schönherr, S., et. al. תיוג אימונולוגי משולב של העתק אופטוגנטי ושבר הקפאה כדי לבחון סידור ספציפי לקלט של קולטני גלוטמט באמיגדלה של העכבר. J. Vis. exp. (2016)

סרטון זה מדגים את התיוג החיסוני של העתקים שבורים בהקפאה של רקמת מוח עכבר למיקרוסקופ אלקטרונים. ההעתקים השבורים והמצופים מתעכלים כדי לחשוף קולטנים. נוגדנים משניים ראשוניים ובעלי תווית זהב מתווספים כדי לסמן קולטנים ספציפיים של ממברנה עצבית. ההעתק מותקן על רשת ומוצג תחת מיקרוסקופ אלקטרונים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבחינת אתיקה של בעלי חיים.

1. הכנת דגימה

1. קיבוע מוח
   1. הכנת הקיבוע
      1. עבור 1 ליטר של קיבוע, שקלו 10 גרם פרפורמלדהיד והוסיפו אותו ל-300 מ"ל מים נטולי יונים (H₂O). מחממים ל 55 - 60 מעלות צלזיוס למשך ~ 10 דקות תוך ערבוב מתמשך.
      2. כבו את האש והוסיפו 7 - 8 טיפות של 4 N נתרן הידרוקסיד (NaOH). הפתרון אמור להתבהר תוך ~10 דקות.
      3. תן לו להתקרר לטמפרטורת החדר או RT, הוסף 150 מ"ל של תמיסה רוויה של חומצה פיקריקית, והביא אותו ל -500 מ"ל עם H נטול יונים ₂O.
      4. הוסף 500 מ"ל של 0.2 M מאגר פוספט (PB). מסננים עם נייר פילטר. התאם את ה-pH ל-7.4 עם NaOH.
      5. יש לקרר את הקיבוע ל-6 מעלות צלזיוס, ולאחסן אותו בבקבוקי זכוכית כהים לא יותר מיום אחד בטמפרטורה של 6 מעלות צלזיוס.
   2. } פרפוזיה טרנס-לבבית
      1. הרדמה עכברים עם זריקה תוך-צפקית של תיופנטל (120 מ"ג/ק"ג משקל גוף). ודא שהחיה מורדמת עמוק על ידי בדיקת רפלקס נסיגת הדוושה, שאמור להיעדר. הניחו את החיה על גבה על שולחן זלוף כשארבעת הגפיים קשורות כלפי מטה.
      2. פתח את דופן הבטן לאורך בעזרת מספריים קהים ובצע שני חתכים נוספים לרוחב לאורך גבול הזנב של כלוב הצלעות כדי לחשוף את הסרעפת. חותכים את הסרעפת וחותכים את דופן בית החזה בגבול האוסטיאוקרטי משני הצדדים. הרם את קצה הזנב של הלוח המרכזי של דופן בית החזה המכיל את עצם החזה כדי לחשוף את הלב.
      3. הסר את קרום הלב ובצע חתך קטן ומדויק בקצה החדר השמאלי כדי להכניס את הצינורית של מנגנון הזילוף. השתמש בצינורית קהה בקוטר פנימי של 0.6 מ"מ. העבירו את הצינורית בעדינות דרך החדר עד שהקצה מופיע לתוך אבי העורקים העולה, ואבטחו את הצינורית בעזרת clamp. כדי לאפשר לדם ולפרפוזה לצאת מזרם הדם, בצע חתך בפרוזדור הימני.
      4. לחלחל עכברים דרך הלב באמצעות משאבה פריסטלטית בקצב זרימה של 5 מ"ל לדקה בהתחלה עם תמיסת מלח פוספט או PBS (25 מ"מ, 0.9% נתרן כלורי או NaCl, pH 7.4) למשך כדקה אחת, ולאחר מכן קיבוע מקורר קרח למשך 7 דקות.
      5. לאחר הקיבוע, חתכו את ראש העכבר במספריים ולאחר מכן חתכו את העור דרך קו האמצע מהצוואר לאף. הסר את השריר כדי לחשוף את הגולגולת במלואה.
      6. בעזרת מספריים חדים, בצע חתך אורכי דרך העצמות העורפיות והבין-קודקודיות החל מהנקב מגנום. בעזרת פינצטה עדינה הסר את העצמות הללו כדי לחשוף את כל המוח הקטן. לאחר מכן בצע חתך אורכי נוסף דרך העצמות הקודקודיות והקדמיות עד לעצם האף והסר אותם בעזרת פינצטה כדי לחשוף את כל המוח.
      7. בעזרת מרית, הסר את המוח מבלי לפגוע בו והנח אותו בקור קרח של 0.1 M PB.
2. חתך וקיצוץ של הדגימות
   1. חותכים גוש עטרה של כ-5 - 6 מ"מ עם סכיני גילוח המכילים את אזור העניין. הדביקו אותו על מחזיק הוויברוסלסר בעזרת דבק ציאנואקרילט. כוונו את גוש הרקמות כך שהניאו-קורטקס יפנה אל הלהב הרוטט. חתכו חלקים עטרתיים שמכילים את האמיגדלה ב-140 מיקרומטר עם הוויברוסליצר (Figure 1A) ב-0.1 M PB קר כקרח, ואספו אותם בצלחת של 6 בארות באותו מאגר.
   2. תחת סטריאומיקרוסקופ, חתכו את אזור העניין (כאן, הצביר הפרה-קפסולרי הבינוני-גבי של מסות התאים המשולבות של האמיגדלה או ITC; ראו איור 1B) מהפרוסה. עשו זאת בצלחת פטרי מצופה באלסטומר סיליקון וממולאת ב-0.1 M PB, באמצעות אזמל עיניים. ודא שהבלוקים הגזומים מתאימים לחור של המרווח (כ-1.5 מ"מ) (איור 1B).
   3. העבר את הבלוקים הגזומים לתמיסת הגנה מפני הקפאה (30% גליצרול ב-0.1 M PB) למשך הלילה (O/N) בטמפרטורה של 6 מעלות צלזיוס.

2. הקפאה בלחץ גבוה

הערה: תיוג חיסוני העתק של שבר הקפאה (FRIL) מורכב מ-6 שלבים חיוניים (איור 2): 1) הקפאה מהירה בלחץ גבוה (ב-2,300 - 2,600 בר) של הדגימה. 2) שבר של הדגימה. מישור השבר בדרך כלל עוקב אחר הליבה ההידרופובית המרכזית של ממברנות קפואות, ומפצל אותן לשני עלעלים חצי-ממברניים: מחצית הסמוכה לפרוטופלזמה (P-face) ומחצית הסמוכה לחלל החוץ-תאי או האקסופלזמי (E-face). 3) שכפול הדגימה על ידי שקיעת ואקום של פלטינה ופחמן. 4) עיכול חומרי ניקוי של הרקמה. 5) תיוג Immunogold. 6) ניתוח העתק באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת.

1. הכנת מנשאי נחושת
   הערה: כדי לטפל בשלבים העוקבים של הליך FRIL, יש להרכיב דגימות על נושאי מתכת (זהב או נחושת). מנשאים אלה משתנים בגודלם ובעיצובם בהתאם לאופן השבירה וסוג המכונות בהן נעשה שימוש. כאן, השתמשנו בנשאי נחושת (איור 1B, E) וב"טבלת העתק כפולה" (ראו איור 3B), שכאשר היא נפתחת, מייצרת שבר מתיחה דרך הדגימה הקפואה ( איור 2). זה מאפשר לשמור ולשכפל את שני הצדדים של הדגימה השבורה.
   1. מנשאי נחושת פולניים עם מסיר כתמים באמצעות יריעת עור קמואה.
   2. מניחים את המנשאים בסיר זכוכית ומנקים פעמיים עם חומר ניקוי לא יוני (pH ~ 1.5) באמבט מים סוניקטיביים, לאחר מכן שוטפים בהרחבה במי ברז ואחריהם מים נטולי יונים, ולאחר מכן שוטפים פעמיים באתנול.
   3. סוניקציה של נשאי הנחושת באצטון למשך 15 דקות.
   4. הנח את המנשאים על נייר סינון לייבוש.
   5. חבר טבעת של סרט דו צדדי למנשא נחושת (איור 1C), שישמש כבאר האחיזה לבלוק הגזוז (מנשא אחיזה).
2. הקפאת הדגימה
   הערה: יש לטפל בחנקן נוזלי בזהירות ולהרכיב משקפי מגן מתאימים.
   1. הפעל את יחידת ההקפאה בלחץ גבוה (איור 1F) למשך 1.5 שעות לפחות לפני הקפאת הדגימה.
   2. התחל לחמם על ידי לחיצה על כפתור "AIR HEATER", ואופה במשך 50 דקות. הגדר את טמפרטורת האוויר ל-80 מעלות צלזיוס.
   3. חבר את מיכל החנקן ליחידת ההקפאה בלחץ גבוה ולחץ על כפתור "חנקן" כדי למלא את הדיואר הפנימי בחנקן נוזלי. מנורת "רמת החנקן" נדלקת. התחל לקרר על ידי לחיצה על כפתור "קירור".
   4. לחץ על כפתור "DRIVE IN" כאשר "רמת החנקן" כבה. בדוק שהמערכת ההידראולית מזיזה את הבוכנה קדימה ואחורה 3 פעמים.
   5. לחץ על כפתור "AUTO" ועל כפתור "NITROGEN". ברגע ש"READY" נדלק, יחידת ההקפאה בלחץ גבוה מוכנה להקפאה בלחץ גבוה.
   6. הניחו בלוק גזום בחור של הסרט הדו-צדדי ( איור 1B) באמצעות לולאת חוט פלטינה שהותכה לתוך פיפטה מזכוכית.
   7. הסר את עודפי תמיסת ההקפאה באמצעות נייר פילטר או מברשת.
      הערה: הליך זה חשוב גם להסרת בועות אוויר שעלולות להיווצר סביב הרקמה ועלולות לגרום לעיוות של צורת הרקמה ו/או אולטרה-מבנה.
   8. תחת סטריאומיקרוסקופ, כסו את מנשא האחיזה במנשא אחר, כך שגוש הרקמות יהיה דחוס בין שני הנשאים.
   9. הכנס את כריך המנשא למחזיק הדגימה של יחידת ההקפאה בלחץ גבוה (איור 1D). הכנס את מחזיק הדגימה ליחידת ההקפאה בלחץ גבוה (טיפ כלפי מטה) ואבטח אותו על ידי הברגת מחזיק הדגימה.
   10. התחל את מחזור ההקפאה על ידי לחיצה על כפתור "Jet-Auto". בעבודה מהירה ככל האפשר, הסר את מחזיק הדגימה וטבל את הקצה בחנקן נוזלי לתוך קופסה מבודדת. טבלו את קצותיהם של שני זוגות מלקחיים בחנקן הנוזלי כדי לקרר אותם.
   11. הסר בזהירות את כריך המנשא ממחזיק הדגימה והניח אותו בקריוביאל מקורר מראש. ודא שהמנשאים מטופלים רק במלקחיים מקוררים בחנקן נוזלי. יש לנקב את הקריוביאלים כדי לאפשר לחנקן לזרום החוצה מהבקבוקון (איור 1G).
   12. חזור על שלבים 2.2.6 עד 2.2.11 עד שכל הדגימות הרצויות הוקפאו. ניתן לאחסן מספר כריכי נשא המכילים את אותו סוג של דגימה באותו בקבוקון.
   13. אחסן את הקריוביאלים המכילים את הנשאים בקריוטנק עד לשכפול ( איור 1H).

3. הקפאה-שבר ושכפול

1. הכנת תותחי קרן האלקטרונים
   1. לפני הכנסת תותחי קרן האלקטרונים, הסר את המגן עם "לוחית הסטה". הנח את "מד ההגדרה" כדי למרכז את החוט לתוך תושבת הקולט דרך מכסה הקתודה התחתון.
      הערה: קצה הקוטר הגדול יותר של מד ההגדרה משמש לאקדח הפחמן, ואילו הקצה בקוטר הקטן יותר משמש לאקדח הפלטינה.
   2. החלק את החוט החדש מעל המד עד ש"למינאות הלחץ" יכולות להדק את קצות החוטים, ולהבטיח שסליל החוט אינו מונח בזווית.
   3. הסר את מד ההגדרה והכנס את מוט הפחמן. תקן את זה על ידי הידוק צ'אק הקולט של מחזיק מוט המאייד, וודא שגובה קצה המוט נמצא באמצע הסליל השני מלמטה. עבור אקדח הפלטינה, גובה קצה מוט הפלטינה צריך להיות באמצע סליל הנימה השני מלמעלה.
   4. החזר את לוחית הסטה והכנס אקדחים ליחידת שבר ההקפאה. נקו את האקדחים עם התזת חול לאחר השימוש.
2. הגדרת יחידת שבר הקפאה
   1. הפעל את יחידת שבר ההקפאה (איור 3A) על ידי הפיכת MAINS ל-1. לתיאור מפורט של הליכי ההקפאה-שבר והשכפול, עיין בהוראות ההפעלה שסופקו על ידי היצרן.
   2. לפני קירור מכשיר שבר ההקפאה, אפו את כל מערכת הקירור של היחידה באוויר חם. לחץ על כפתור "הפשרה" במכשיר MTC 010 (יחידת בקרת טמפרטורה) ( איור 3A) ותן לתהליך האפייה לפעול במשך 45 דקות.
   3. הפעל את תחנת הוואקום. יחידת שבר ההקפאה-שבר פועלת בדרך כלל בטווח ואקום של ~10^-6 - 10^-7 mbar.
   4. מלאו את מיכל החנקן וחברו אותו ליחידת שבר ההקפאה. בדוק שמחזיק השסתום יבש ונקה גם את כניסת המיכל לפני הכנסת מחזיק השסתום (לחות עלולה להפריע לוואקום ולאינדיקציה של מילוי N₂ של המיכל).
   5. התחל בקירור על ידי הגדרת הטמפרטורה ל-115 מעלות צלזיוס. הקירור אורך כ-45 דקות.
   6. הכנס את תותחי קרן האלקטרונים והתאם את הזרם והמתח כדי להגיע לפרמטרים הבאים לאידוי:
      אקדח פחמן: סיבוב מופעל, מיקום 90°, קצב הצטברות פחמן 0.1 - 0.2 ננומטר/שנייה
      אקדח פחמן-פלטינה: סיבוב כבוי, מיקום 60°, קצב הצטברות 0.06 - 0.1 ננומטר/שנייה
      הערה: אם נעשה שימוש באקדח בפעם הראשונה לאחר החלפת מוט הפחמן או הפלטינה, יש להסיר את הגז למשך 3 דקות לפני השימוש.

3. שבירה ושכפול

   1. הכנס כריכי נשא קפואים לשולחן העתק כפול וודא שכל המניפולציות נעשות בחנקן נוזלי.
   2. העבר את שולחן ההעתק הכפול לכלי Dewar וקבע אותו למקלט שלב הדגימה בזווית של 45°. רמת החנקן הנוזלי צריכה להיות תמיד מעל טבלת ההעתק הכפול.
   3. הרם את שולחן ההעתק הכפול עם מניפולטור השולחן והכנס אותו ליחידת שבר ההקפאה על הבמה הקרה. המתן כ-20 דקות כדי לאפשר לטמפרטורה של טבלת ההעתק הכפול להסתגל ל-115 מעלות צלזיוס.
   4. בדוק שהוואקום נמוך מ-10^-6 mbar והטמפרטורה היא -115 °C.
   5. שבר את הרקמה על ידי סיבוב ידני נגד כיוון השעון של הגלגל המחובר לתכריך הממוקם מעל שולחן ההעתק הכפול. כאשר התכריכים מסתובבים, הוא מאלץ את שולחן ההעתק הכפול להיפתח, ושובר את הרקמה.
   6. לחץ על כפתור "מתח גבוה" במכשיר EVM 030 (יחידת בקרת אידוי קרן אלקטרונים) של יחידת שבר ההקפאה ( איור 3A).
   7. שכפל את המשטחים החשופים של הרקמה השבורה ( איור 3C) על ידי אידוי פחמן (סיבוב) באמצעות אקדח קרן אלקטרונים הממוקם בזווית של 90 מעלות לעובי של 5 ננומטר, ואחריו הצללה חד כיוונית עם פלטינה-פחמן בזווית של 60 מעלות לעובי של 2 ננומטר. לבסוף, מרחו שכבה של פחמן בעובי 15 ננומטר מזווית של 90 מעלות (מסתובבת).
   8. השתמש בפרמטרים הבאים לאידוי:
      פחמן ראשון: סיבוב על, מיקום 90°; מהירות 0.1 - 0.2 ננומטר לשנייה; 5 ננומטר
      פחמן-פלטינה שני: מיקום 60°; מהירות 0.06 - 0.1 ננומטר לשנייה; 2 ננומטר
      פחמן שלישי: סיבוב על, מיקום 90°; מהירות 0.3 - 0.5 ננומטר לשנייה; 15 ננומטר
   9. הסר את הדגימות המשוכפלות מיחידת שבר ההקפאה והעביר אותן לצלחת קרמית של 12 בארות (איור 4A) מלאה ב-TBS (תמיסת מלח Tris-buffered, pH 7.4).
   10. בעזרת מוט תיל לולאת פלטינה, הסר את הרקמה המשוכפלת מנשא הדגימה ( איור 4A).
   11. חזור על שלבים 3.3.1 עד 3.3.10 עד שכל הדגימות ישוכפלו.

   4. עיכול SDS של העתק

   1. העבירו את ההעתק לבקבוקון זכוכית של 4 מ"ל מלא ב-1 מ"ל של מאגר עיכול SDS (2.5% נתרן לאוריל סולפט, 20% סוכרוז ב-15 מ"מ טריס, pH 8.3). לעכל במשך 18 שעות בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס עם ניעור (45 פעימות לדקה).
   2. העבירו העתקים לצינור חדש מלא במאגר עיכול SDS ואחסנו ב-RT.

4. תיוג חיסוני

הערה: כל הדגירה מבוצעת ב-RT עם ניעור עדין למעט דגירה עם נוגדנים.

1. שטפו את ההעתק למשך 10 דקות במאגר עיכול נתרן דודציל סולפט (SDS) טרי.
2. שטפו את ההעתק פעם אחת עם 2.5% BSA (אלבומין בסרום בקר) ב-Tris-Buffered Saline או TBS למשך 5 דקות, ולאחר מכן 3 x 10 דקות עם 0.1% BSA ב-TBS.
3. חסום אתרי קשירה לא ספציפיים ב-TBS עם 5% BSA למשך שעה אחת.
4. החל נוגדנים ראשוניים מדוללים ב-2% BSA-TBS. בצע דגירה בטיפה של 30 מיקרוליטר (איור 4B) בתא לח בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות (איור 4C).
   1. למחקר זה, עבד את שני ההעתקים מהרקמה השבורה. דגרו העתק אחד עם נוגדן רב-שבטי של שרקנים המורם כנגד חומצות האמינו 717 - 754 של העכבר GluR1 המשותף לכל תת-היחידות של קולטן חומצה α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic או AMPA-R (דילול: 1:200) או נוגדן חד שבטי של עכבר המוגבה כנגד חלבון היתוך רקומביננטי המכסה חומצות אמינו 660 - 811 של תת-היחידה NR1 של קולטן N-Methyl-D-Aspartate או NMDA-R (דילול: 1:500), ונוגדנים רב-שבטיים של ארנב מורמים כנגד החלבון הפלואורסצנטי הירוק (דילול: 1:300).
   2. דגרו את ההעתק השני עם נוגדן רב-שבטי של ארנב המורם כנגד פפטיד סינתטי המתאים לחומצות אמינו 384 - 398 של קולטן μ-אופיואידים של חולדה (דילול: 1:500).
5. יש לשטוף ב-TBS עם 0.05% BSA (3 x 5 דקות).
6. יש למרוח נוגדנים משניים. למחקר זה, השתמשו בנוגדנים מצומדים זהב (5 ננומטר לקולטני גלוטמט יונוטרופיים, 10 לקולטני μ-אופיואידים, ו/או 15 ננומטר עבור חלבון פלואורסצנטי צהוב Channelrhodopsin-2 או ChR2-YFP) מדוללים ב-TBS עם 2% BSA. יש לדלל נוגדנים משניים ב-1:30 ולדגור בטיפה של 30 מיקרוליטר ב-15 מעלות צלזיוס O/N.
7. יש לשטוף 3 x 5 דקות ב-0.05% BSA-TBS ב-RT.
8. יש לשטוף 2 x 5 דקות במים טהורים במיוחד.
9. הרכיב העתק על רשת פסים מקבילים של 100 שורות מצופה formvar ( איור 4D).

תוצאות

איור 1. הכנת רקמות והקפאה בלחץ גבוה. (A) ויברוסליצר משמש לחיתוך הרקמה. (B) קטע מוח עכברי עטרה שנוצר המכיל את האמיגדלה מוצג זה לצד זה עם מנשא נחושת המצויד בטבעת של סרט דו צדדי. התיבה המקווקו מציינת את אזור ה...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
הכנת
Paraformaldehyde EM grade	Agar Scientific Ltd., United Kingdom	AGR1018
תמיסת חומצה פיקרית רוויה	Sigma-Aldrich, USA	P6744-1GA
Na2HPO4-2H20	Merck Millipore, Germany	1065860500
NaH2PO4-2H2O	Merck Millipore, Germany	1063451000
NaCl	Merck Millipore, Germany	1064041000
4N NaOH	Carl Roth, Germany	T198.1
Thiopental	Sandoz, Austria	5,133
Glycerol	Sigma-Aldrich, USA	G5516-500ML
GenPure ultrapure water system	Thermo Fisher Scientific, USA	50131235
משאבה פריסטלטית	ISMATEC, גרמניה	ISM 930C
נייר סינון	MACHEREY-NAGEL, Germany	MN 615 1/4
Vibroslicer, VT1000S	Leica Microsystems, Austria
אזמל עיניים	מעבדות אלקון, ארה"ב
צינורית פרפוזיה	Vieweg, Germany	F560088-1
High-pressure Freezing
נושאי נחושת	Engineering Office M. Wohlwend, CH<
Sidol פולנית	הנקל, גרמניה
Chamois skin	חנות לציוד ביתי
ניקוב חור, 1,5mm	Stubai, Austria
Denatured ethanol	Donauchem, Austria
Acetone	Roth, Germany	9372.5
מכונת הקפאה בלחץ גבוה HPM 010	BalTec, CH; now Leica Microsystems	HPM010
Stereo-microscope	Olympus, Japan	SZX10
Liquid nitrogen
Cryo-vials	Roth, Germany	E309.1
CryoCane	Nalge Nunc International,USA	5015-0001
CryoSleeve	Nalge Nunc International,USA	5016-0001
Liquid nitrogen	Cryopal, France	GT38
חומר ניקוי לא-יוני (Lavocid)<
freeze-fracture and Replication
Sandblaster, Mikromat 200-1	JOKE Joisten & Kettenbaum, Germany	SANDURET 2- K
סיליציוםקרביד SIC 360, גודל גרגר 25 - 21μ	JOKE Joisten & Kettenbaum, Germany	955932
הקפאת מערכת שבר BAF 060	BalTec, CH; now Leica Microsystems	BAF060
Ceramic 12 well	גרופל, אוסטריה	14511
Trizma base	SIGMA, USA	T1503
Trizma hydrochloride	SIGMA, USA	T3253
נתרן כלורי<	1,06,40,41,000
SDS, נתרן לאוריל סולפט	Roth, Germany	5136.1
Sucrose	Merck, Germany	1,07,68,71,000
TRIS	Roth, Germany	5429.3
Universal Hybridization Oven	Binder, Germany	7001-0050
Immunolabelling
BSA	SIGMA, USA	A9647
Anti-GFP Antibody	Molecular Probes, USA	A11122
Anti-pan-AMPAR Antibody	Frontier Institute, Japan	pan AMPAR-GP-Af580-1
Anti-NMDAR1 Antibody, clone 54.1	Merck Millipore, Germany	MAB363
Opioid Receptor-Mu (MOR) Antibody	ImmunoStar, USA	24216
EM עז אנטי-שרקן, 5 ננומטר; נוגדן משני	BBInternational,	EM. GAG5
EM עז אנטי-ארנב, 15nm; נוגדן משני	BBInternational,	EM. GAR15
חמור נגד ארנב, 10 ננומטר, נוגדן משני<	DAR 10nm
רשתות נחושת, 100 Parallel Bar	Agar scientific, UK	G2012C
Incubator	Major Science, USA	MO-RC
Pioloform Powder	Agar scientific, UK	R1275
Chloroform	Roth, Germany	3313.1

רקמותtd style='width:153pt;'>528 Storage vesseltd style='width:164pt;'>Werner & Mertz Professional, Germany platetd style='width:164pt;'>Merck, Germanytd style='רוחב:164pt;'>AURION, הולנד