פלתיסמוגרפיה ורישום אלקטרומיוגרפיה בו זמנית במודל עכבר ALS

תקציר

מקור: Jensen, V. N., et al. מדידה חוזרת של פעילות שרירי הנשימה ואוורור במודלים של עכברים של מחלות עצב-שריר. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מדגים את השיטה להקלטת אותות פלתיסמוגרפיה ואלקטרומיוגרפיה בו זמנית במודל עכבר ALS הנע בחופשיות. ההליך כולל שימוש באלקטרודות מושתלות ומשדר כדי ללכוד את פעילות השרירים, לצד תא פלתיסמוגרפיה לניטור דפוסי נשימה, כדי לחקור את תפקידם של שרירי העזר בעכבר ALS.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הכנת העכבר לניתוח

1. בחר את העכבר הרצוי להשתלה ( כלומר, SOD1(G93A) או ביקורת) ושקול את החיה.
   הערה: הגיל והמשקל המומלצים לעכבר (זכר או נקבה) שעוברים ניתוח זה הם P56 - P120 ו-≥ 24 גרם, בהתאמה.
2. להרדים את העכבר מתחת לאיזופלורן 3.5% עם קצב זרימת חמצן של 2 ליטר לדקה. בצע צביטה בבוהן וצביטה בזנב כדי לוודא שהעכבר מורדם לחלוטין.
3. לאחר ההרדמה, הסר את העכבר מקופסת הטיפה ושמור על הרדמה דרך חרוט אף על ידי הגדרת רמת האיזופלורן ל-1.5% וקצב זרימת החמצן ל-1 ליטר לדקה. בצע צביטה בבוהן ו/או צביטת זנב כדי לוודא שההרדמה נשמרת.
4. מרחו משחת עיניים למניעת התייבשות העיניים במהלך הניתוח.
5. גלחו את העכבר כדי לחשוף אזור ניתוח בין האוזן לכתף ( איור 1C).
6. הצמידו את ציפורני הרגליים במקביל לאתר הניתוח כדי להפחית את הסיכוי שהעכבר ישלוף את המוליכים או יגרום לפצעים על ידי גירוד במהלך תהליך הריפוי.
7. ספוגית לסירוגין את אתר הניתוח, תחילה עם חומר חיטוי ולאחר מכן עם איזופרופנול. חזור על הפעולה פעמיים נוספות.

2. השתלת מכשיר הטלמטריה כדי לתעד את פעילות האלקטרומיוגרפיה של סקאלן וטרפזיוס (EMG)

1. הנח את החיה מתחת למיקרוסקופ דיסקציה, על צדה על גבי כרית סטרילית המכסה כרית חימום, ואבטח את חרוט האף במקומו באמצעות סרט. שימו לב שעדיף להשתיל את הצד הימני כדי להפחית את אות האלקטרוקרדיוגרמה (ECG) שמקורו בלב.
   הערה: עקוב אחר הנשימה והתאם את רמות האיזופלורן, במידת הצורך, כדי לשמור על קצב נשימה קבוע ומישור הרדמה כירורגי מתאים.
2. משוך את הגפה הקדמית לכיוון כף הרגל המקבילה לאורך פלג הגוף העליון.
   הערה: תנוחה זו עוקרת את עצם השכמה באופן זנבי, ומספקת גישה כירורגית לשרירי הסקלן והטרפז.
   1. קח את המלקחיים המעוקלים הקהים, החזק את הכפה הקדמית המקבילה לאתר הניתוח, והדביק את הכפה במקומה (איור 1C). השתמש בסרט כירורגי דביק חזק כדי לוודא שהכפה מאובטחת למשך ההליך.
3. לבש זוג כפפות כירורגיות טריות. השתמשו באזמל כדי ליצור חתך אלכסוני, באורך של כ-2 סנטימטרים, בין הכתף לאוזן (קו אדום ב-איור 1C).
4. באמצעות שני מלקחיים #2 למינקטומיה, אחד בכל יד, משוך לאחור את כרית השומן ופזר את שרירי הטרפז והפלטיזמה כדי לחשוף את הפאשיה המכסה את שרירי הסטרנוקלידומסטואיד והסקלן (איור 1D ו-E).
5. השתמש בשריר הסטרנוקלידומסטואיד החיוור ובעצב הפרני כציוני דרך לזיהוי שרירי הסקלן. שימו לב שהעצב הפרני פועל במקביל לשרירי הסקלן, בעוד שהסטרנוקלידומסטואיד נמצא נחות. שרירי הסקלן עוברים בצורה אלכסונית מחוליות צוואר הרחם לצלעות מתחת לשריר הטרפז. מוליכים ביו-פוטנציאליים יוחדרו לשריר הסקלן הקדמי, שיכול להיות מזוהה כשריר שעובר בסמוך לעצב הפרני (איור 1F ו-G).
   הערה: זהירות. אזור זה הוא בעל כלי דם גבוהים, ויש להקפיד להימנע מחיתוך העורק התת-בריחי. הימנע מפגיעה בעצב הפרני ובמקלעת הזרוע.
6. לאחר ששרירי הסקלן והטרפז זוהו (איור 1G), צרו כיס תת-עורי עבור המשדר בגב החיה, בין עצם השכמה.
   1. השתמש במספריים המפרידים רקמות. הכניסו את הקצוות הקהים ממש מתחת לעור ופזרו אותם עד שנוצר פתח כיס בערך פי 1.25 מרוחב המשדר (איור 1H).
      הערה: יש להכניס את המשדר עם התנגדות מינימלית, אך הכיס לא צריך להיות גדול כל כך שהמשדר יוכל לנוע בכוחות עצמו. אם הכיס קטן מדי, המשדר עלול להתחכך בעור ולגרום לגירוי שעלול לגרום לבעל החיים לשרוט את העור ו/או לשלוף את העופרת החוצה. אם הכיס גדול מדי, עלולה להיווצר סרומה, או שהמשדר יכול לנדוד למצב לא נוח.
7. שטפו במי מלח חמים וסטריליים והכניסו את המשדר כשהצד השטוח יותר כנגד השריר. מקמו את המשדר כך שהוא יהיה שטוח והחוטים יוצאים מהכיס, במקביל זה לזה ולא מעוותים (איור 1I). סלסל כל אורך עודף של חוט מתחת למכשיר והנח אותו שטוח.
8. העבירו את המוליכים מהמשדר לשרירי הסקלן והטרפז כך ששתי קבוצות המוליכים הדו-פוטנציאליים ישכבו שטוחים ומקבילים זה לזה.
9. השתמש במלקחיים למינקטומיה כדי להפריד את הסקלן הקדמי מהשרירים שמסביב והכנס מחט בגודל 25 בניצב לסיבי השריר דרך שריר הסקלן.
   1. הכניסו חוט אחד לקצה המחט ואז משכו את המחט החוצה מהשריר, והשאירו מאחור את העופרת המוכנסת לשריר עד לבידוד החוט (איור 1J ו-K). רשום אילו מובילים צבעוניים מוכנסים לאיזה שריר.
10. הניחו טיפה קטנה של דבק ציאנואקרילט על הקצה החשוף של החוט, קרוב לשריר שבו מוכנס העופרת, והחליקו במהירות את מכסה העופרת מעל החוט כך שלא ייחשף חוט בין מכסה העופרת לשריר (איור 2A ו-B).
    הערה: למרות שזה נוהג מקובל לאבטח מובילי EMG עם ציאנואקרילט, שיטה חלופית היא לקשור קשר תפר משי סביב מכסה העופרת.
11. חתוך את החוט העודף דיסטלי למכסה והחל טיפה של דבק ציאנואקרילט על קצה מכסה/חוט העופרת. תנו לדבק זמן להתפלמר לפני השחרור (איור 2C ו-D).
12. בצע את אותם שלבים (שלבים 3.10-3.12) כדי להכניס את מוביל הקוטביות ההפוך במקביל לראשון באותו שריר, במרחק של 1 - 2 מ"מ מהמובילה הראשונה.
13. חזור על שלבים 3.10 - 3.12 כדי להכניס מוליכים לשריר הטרפז, שממוקם ממש לפני שריר הסקלן ( איורים 1L ו-M).
14. ודא שכבלי החוט קבועים במקומם ושיש מספיק רפיון כדי שהחיה תבצע תנועות גוף מבלי למשוך אותם. ודא שכל אורך עודף של עופרת לא ידחוף את העור, מכיוון שהדבר עלול לגרום לגירוי שעלול לגרום לבעל החיים לשרוט או לשלוף את העופרת החוצה. מקם מחדש את המובילים, במידת הצורך, כדי למנוע אי נוחות אפשרית.
15. הסר בעדינות את הסרט המחזיק את הגפה הקדמית. משוך את כרית השומן לאחור מעל השריר והשתמש בה כדי לכסות את המוליכים שהוכנסו. סגור את החתך עם דבק ציאנואקרילט על ידי התגרות בדשי העור בחזרה כך שהחתך מתיישר. צבטו חלק מדשי העור יחד עם המלקחיים המעוקלים ומרחו קו קטן של דבק ציאנואקרילט לאורך קו זה.
16. יש להזריק 0.1 מ"ל קרפרופן תת עורי כדי להקל על כאבים לאחר הניתוח בזמן שהחיה עדיין תחת הרדמה.
    הערה: המשך לתת 0.1 מ"ל קרפרופן פעם ביום במשך 1-2 ימים לאחר הניתוח, ולאחר מכן לפי הצורך.
17. הוציאו את החיה מהאף והניחו אותה בכלוב נקי באינקובטור שחומם מראש עד שהיא ערה ונעה סביב הכלוב מרצון. לאחר מכן, שמור את החיה בחממה למשך 15 דקות לפחות, תוך מעקב אחר תנועותיה וערנותה.

3. טיפול לאחר הניתוח

1. } חיות בית בנפרד לאחר ניתוח. ספקו לבעלי חיים מרפאים ג'ל דיאט ובקבוק מים.
2. עקוב אחר בעל החיים במשך 30 הדקות הראשונות לאחר הניתוח. בדוק את בעל החיים לפחות כל שעה במשך 5 שעות לאחר הניתוח. בימים שלאחר הניתוח, יש לבדוק לפחות פעמיים ביום.
3. שימו לב לנמק, זיהום לאורך החתך ובתוך חלל הגוף המכיל את השתל (כלומר, חום, נפיחות ואדמומיות), והיווצרות סרומה.
   הערה: הסימנים האלה מופיעים בשבוע הראשון אחרי הניתוח. איור 1N מראה חיה בריאה שנרפאה חודש אחרי הניתוח. למרות שניתן לבצע הקלטות EMG מיד לאחר ההשתלה, לבעלי החיים ניתן לפחות שבוע להחלים לפני רישום EMG ופלתיסמוגרפיה, מכיוון שאותות א.ק.ג יכולים להיות גבוהים מיד לאחר ההשתלה.

4. רכישת אותות אלקטרומיוגרפיה ופלתיסמוגרפיה סימולטניים

1. הפעל את כל ציוד הרכישה, כולל זרימת הטיה.
   הערה: קצב הזרימה של עכברים מוגדר בדרך כלל ל-1.0 ליטר/דקה.
2. כייל את תאי הפלתיסמוגרפיה באמצעות מד זרימה.
   הערה: בדוק מעת לעת את תאי הפלתיסמוגרפיה כדי לוודא שהאטמים אינם סדוקים או שבורים. כדי לשמור על מצבם הטוב, מצפים את אטמי הגומי בחומר סיכה כגון שומן ואקום פעם בשבוע.
3. כיול משדר קלט כפי שצוין על ידי היצרן.
4. הנח את העכבר בתא הפלתיסמוגרפיה למשך שעה אחת לפחות כדי להתאקלם לפני רישום EMG ופלתיסמוגרפיה. באמצעות מספר תאים, ניתן להקליט מעכבר אחד בזמן שהעכבר הבא מתאקלם בתא שני. אל תפעיל את המשדר במהלך תקופת ההסתגלות כדי לחסוך בסוללה ( איור 1O).
5. לפני ההקלטה (אך לאחר כיול), הפעל את המשדר על ידי הצבת מגנט חזק בטווח של 1 אינץ' מהחיה המושתלת; נורה אדומה בחזית המקלט תציין מתי המשדר פועל.
6. התחל את הרכישה באמצעות התפריט הנפתח שכותרתו "רכישה" ובחר "התחל רכישה". למרות שמשך ההקלטה עשוי להשתנות בהתאם לניסוי, פלתיסמוגרפיה טיפוסית והקלטת EMG נמשכת 1 - 3 שעות.
   הערה: למשדר יש קצב דגימה פנימי של 240 הרץ. קצב מהיר יותר של 500 הרץ מוגדר בתוכנה כדי לבצע אינטרפולציה בין נקודות ולספק צורת גל חלקה יותר. מסנן המעבר הנמוך (המשמש כמסנן אנטי-כינוי) ומסנן המעבר הגבוה בשתל מציינים את רוחב הפס של 1 עד 50 הרץ עבור מכשיר טלמטריה זה. הפרעות מיזוג אוויר של 60 הרץ אינן תורמות לרעש עודף באות ה-EMG מכיוון שהשתלים מופעלים על ידי סוללה, והחיה מגנה על השתל ומובילה מפני שדות חשמליים. פלתיסמוגרפיה, EMG ווידאו מסונכרנים אוטומטית בזמן אמת באמצעות תוכנת רכישה .
7. בסיום הרכישה, כבה את המשדר עם מגנט והסר את החיה מהתא.

תוצאות

איור 1. השתלת מכשיר טלמטריה למדידת EMG של שרירי הנשימה. (A) משדרי טלמטריה עם שני זוגות מובילים ביו-פוטנציאליים למדידת EMG. ניתן לחתוך את המוליכים לאורך הרצוי (למטה) או לסלסל ולתחוב מתחת למשדר (למע...

חומרים