גרימת דימום פונטיני מסיבי במודל חולדה על ידי הזרקת דם אוטולוגית

תקציר

מקור: Tang, X. et. al., דימום פונטיני מסיבי על ידי הזרקה כפולה של דם אוטולוגי. J. Vis. Exp. (2021)

פרוטוקול זה מתאר עירוי מבוקר של דם אוטולוגי לאזור הפונטיני במוח של חולדה כדי לדגמן דימום פונטיני מסיבי. המטרה היא לדמות דימום מוחי מקומי על ידי הגברת לחץ מקומי.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים וועדת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. Animal and Instruments
2. השתמש בחולדות Sprague-Dawley זכרות בנות 8 שבועות 250 ± 10 גרם.
3. אכלס את החולדות לפחות 7 ימים לפני הניתוח בתנאי סביבה מבוקרים עם טמפרטורת סביבה של 25 מעלות צלזיוס, לחות יחסית של 65%, ומחזור אור-חושך של 12/12 שעות.
4. ספק מזון ומים ללא הגבלה.
5. הכן את המכשירים (איור 1A-E).

2. להזריק את הדם ל-pons

1. שקלו את החולדות שוב 3 ימים לפני הניתוח כדי לבחור חולדות עם משקל גוף מתאים לניסויים.
2. במהלך 3 הימים שלפני הדוגמנות, אמן את החולדות ללכת על קרן שיווי משקל 3 פעמים ביום כדי להבטיח שחולדות רגילות יוכלו לעבור את קרן האיזון ללא הפסקה.
3. מחממים את כרית החימום ל-37 מעלות צלזיוס לפני ההרדמה.
4. חבר מיקרו-מקדחה למחזיק על המסגרת הסטריאוטקסית.
5. הזריק לחולדות 50 מ"ג/ק"ג קטמין ו-5 מ"ג/ק"ג קסילזין תוך צפקית. המתן עד שלא תהיה תגובת צביטה בבהונות.
6. העבר את החולדה לתוך המסגרת הסטריאוטקסית במצב שכיבה. הניחו את מוטות האוזניים מעל תעלת האוזן כדי לאבטח את הראש. קבע את הגולגולת במצב אופקי כדי למנוע הטיה של ההזרקה (איור 1F).
7. שמור על הרדמה על ידי איזופלורן (97.5% חמצן ו-2.5% איזופלורן) דרך חרוט אף סטריאוטקסי עם יציאת כניסה ויציאה.
8. השתמש במשחת עיניים כדי לשמור על לחות הקרנית.
9. גלח את השיער מעל הגולגולת עם מכונת גילוח זעירה.
10. צייר קו אמצע של 3 ס"מ עם עט טוש בגולגולת מקו הקנתוס הצדדי הדו-צדדי עד 0.5 ס"מ מאחורי הפונטנל האחורי, כפי שמוצג באיור 1F.
11. יש למרוח קרצוף כירורגי אנטויודין בצורה מעגלית, החל מאמצע קו האמצע המסומן ומסתובב כלפי חוץ.
12. הנח את וילון הניתוח.
13. בצע חתך עם אזמל לאורך קו האמצע המסומן.
14. השתמש בצמר גפן כדי להסיר דם פוטנציאלי.
15. הניחו חתיכת מלקחיים על כל צד של דש הקרקפת כדי לחשוף את הגולגולת (איור 1G).
16. טבלו צמר גפן במי מלח של 0.9% והסירו בעדינות את רקמות החיבור מעצם הגולגולת כדי למנוע מרקמות החיבור להיתפס במיקרו-מקדחה.
17. סמן את הנקודה המרכזית של הברגמה כנקודת המוצא באמצעות עט טוש.
18. בצע קרניוטומיה (קוטר 1 מ"מ) באמצעות מיקרו-מקדחה ב-AP-9.0 מ"מ, אורך 0 מ"מ (איור 2B וטבלה 1). המשיכו בזהירות מאחר שהנקודה הזו קרובה מאוד לסינוס הוורידי (איור 1G).
19. הסר את המיקרו-מקדחה מהמסגרת הסטריאוטקסית.
20. הכניסו מזרק המילטון של 100 מיקרוליטר לתוך המחזיק הסטריאוטקסי (איור 1K). הפעל את מתג משאבת ההזרקה, לחץ על כפתור השאיפה המהירה, שאב תמיסת הפרין (12500 U מדולל ב-100 מ"ל מי מלח) ל-100 מיקרוליטר ולאחר מכן רוקן אותה לחלוטין כדי למנוע קרישת דם מהירה מדי.
21. מרחו כלורהקסידין ו-75% אלכוהול על כל הזנב מהשורש ועד הקצה לפחות 3 פעמים כדי לחטא את העור, לרכך את החרמנות ולהרחיב את וריד הזנב כדי להגביר את אחוזי ההצלחה של ההזרקה.
22. חבר דיקור קרקפת למזרק של 1 מ"ל.
23. הכניסו את דיקור הקרקפת לווריד זנב צדדי במרחק של 3 ס"מ מקצה הזנב וקחו 150 מיקרוליטר דם (איור 1H).
24. הסר את דיקור הקרקפת מהמזרק של 1 מ"ל.
25. העבירו את הדם לתוך שפופרת (איור 1I).
    הערה: העבר במהירות כדי למנוע קרישת דם.
26. החלף את הכפפות הכירורגיות.
27. בחר במצב נסיגה, הגדר את עוצמת הקול ל-100 מיקרוליטר, הגדר את המהירות ל-200 מיקרוליטר לדקה, לחץ על כפתור RUN ושאב 100 מיקרוליטר דם למזרק המילטון (איור 1J).
28. בחר במצב Infuse והגדר את המהירות ל-1 μL/min.
29. התקדמו במזרק עד שהקצה יגיע לעומק של 9.2 מ"מ מתחת לפני השטח של המוח (איור 2C ואיור 1L).
30. לחץ על כפתור ההפעלה כדי להזריק את 10 המיקרוליטר הראשונים של דם במהירות של 1 מיקרוליטר לדקה (טבלה 1).
31. הפסק את ההזרקה והשאיר את המזרק במקומו למשך 20 דקות כדי למנוע זרימת דם לחלל התת-עכבישי.
32. משוך את המזרק עד שהקצה מגיע לעומק של 9.0 מ"מ מתחת לפני השטח של המוח.
33. הפעל מחדש את ההזרקה באותה מהירות של 1 μL/min עד להזרקת שאריות הדם במלואן.
34. השאר את המזרק במקומו למשך 10 דקות כדי למנוע זרימת דם חוזרת.
35. הסר את המזרק מהמוח לאט.
36. השתמש במלט עצם כדי לכסות את חור הגולגולת.
37. כאשר המלט מתייבש, יש לתפור את הפצע עם חוט תפר פוליאמיד 4-0. לאחר תפירת 3 או 4 תפרים, קשרו 2-1-1 קשרים כירורגיים סטנדרטיים.
38. כדי למנוע זיהום, יש להזריק לחולדה פניצילין (0.25 מ"ל, 80 יחב"ל מדולל במי מלח של 4 מ"ל) תוך צפקית.
39. להזריק לחולדות תת עורית בוטואורפנול טרטרט (2.5 מ"ג/ק"ג) ולחזור על ההזרקה כל שעתיים כדי להקל על הכאבים לאחר הניתוח עד 24 שעות לאחר הניתוח.
40. התבונן בחולדה כל 15 דקות עד שהיא מתאוששת לחלוטין מההרדמה. החזירו אותו לכלוב המקורי, עם כרית חימום מתחת לכלוב. ספק לחולדה גישה חופשית למזון ומים עד להקרבה.

טבלה 1: הזרקת דם אוטולוגי.

Massive

	Mild	Moderate <
נפח כולל	30 μL	60 μL	100 μL
הזרקה ראשונה
קואורדינטות סטריאוטקטיות	AP -9.0 מ"מ; Lat 0; Vert -9.2 mm
Volume	10 μL	10 μL	10 μL
Speed	1 μL/min	1 μL/min	1 μL/min
מרווח זמן	20 דקות	20 min	20 דקות
הזרקה שנייה
קואורדינטות סטריאוטקטיות	AP -9.0 מ"מ; Lat 0; Vert -9.2 מ"מ		AP -9.0 מ"מ; Lat 0; Vert -9.0 mm
Volume	20 μL	50 μL	90 μL
Speed	1 μL/min	1 μL/min	1 μL/min
לפני משיכת המחט	10 min	10 min	10 min
AP: מיקום anteroposterior
Lat: לרוחב
Vert: vertical

td style='background-color:#ffffff;border:0.625pt solid #1a202c;padding:4pt 2pt;vertical-align:top;'>

תוצאות

איור 1: מכשירים והליך הניתוח. (א) מכונת הרדמה. (ב) מכשירים כירורגיים. (ג) מיקרו-מקדחה. (ד) משאבת מיקרו-הזרקה. (ה) מנגנון סטריאוטקסי. (ו) קו מסומן באמצע הגולגולת. (ז) החץ הצהוב מצביע על מיקום המקדחה. (H) ניקוז דם מווריד הזנב. (I) להעביר את הדם לתוך צינור Eppendorf. (י) שאפו את הדם למזרק המילטון. (יא) קדם את מזרק המילטון דרך חור הגול...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
100ml Saline solution	Guangdong yixiang	191222201 C1	הכנת הפרין מדלל
100μl Microinjector	Shanghai Gaoge		הזרקת דם
1ml מזרק	Jiangsu Zhiyu	20191014	משיכת דם אוטולוגי מווריד
75% אלכוהול	שאנדונג לירקאנג		חיטוי זנב
סרט דבק	Shanghai Jinzhong		Surgicl instruments
Animal Anesthesia	RWD	R510-31S-6	השראת ותחזוקה של הרדמה
קרן איזון<		עבור ציוני גירעון נוירולוגי
מלט עצם<	20180306	מכשירים כירורגיים
Butorphanol tartrate	Jiangsu Hengrui		לניהול כאב
מקדחה גולגולת חשמלית	נאנג'ינג דרווין ביוטכנולוגיה<	יצירת חור בגולגולת
EP tube	Nantong Surui		העברת דם
קרם עיניים אריתרומיצין<	<
כרית חימום	Dangerous Jungle	JR01	שמירה על חום
הזרקת נתרן הפרין	Chengdu Haitong Pharmacal Company	190701	הכנת מדלל
IndoPhors	Guoyao of China		סטריליזציה
Isoflurane	RWD	20080701	השראת ותחזוקה של הרדמה
micro-injection pump	Baoding Leifu	TFD03-01-C	הזרקת דם
מחזיק מחט	Shanghai Jinzhong	J32020	Surgicl instruments
Penicilin	Guoyao of China		מניעת
Q-tips	Jiangxi Songhe		Surgicl instruments
Scalp needle	Jiangxi Hongda	20200313	הוצאת דם אוטולוגי מווריד
אזמל	שנחאי Kaiyuan	170902	Surgicl instruments
מספריים לגזירה	שנחאי ג'ינג'ונג	Y00040	Surgicl instruments
Stereotaxic apparatus	RWD	900-00001-00	למיקום
מגבת כירורגית	Xinxiang Huakangweicai	20070601	Surgicl instruments
מחט תפירה	Shanghai Jinzhong		Surgicl instruments
מספריים תפרים	Shanghai Jinzhong	J25041	Surgicl instruments
מלקחיים המחזיקים רקמות	Shanghai Jinzhong	J31080	Surgicl instruments

אוטולוגית הזנב עכברוש systemtd style='צבע רקע:#ffffff;ריפוד:0px 3px;יישור טקסט:מרכז;יישור אנכי:תחתון;'>ג'יאנגסו סאיאנגסיtd style='צבע רקע:#ffffff;ריפוד:0px 3px;יישור טקסט:מרכז;יישור אנכי:תחתון;'>Shanghai Xinshijitd style='צבע רקע:#ffffff;ריפוד:0px 3px;יישור טקסט:מרכז;יישור אנכי:תחתון;'>20180090018אוטולוגיtd style='צבע רקע:#ffffff;ריפוד:0px 3px;יישור טקסט:מרכז;יישור אנכי:תחתון;'>בית מרקחת יונאןtd style='צבע רקע:#ffffff;ריפוד:0px 3px;יישור אנכי:תחתון;'>הגנה עלהעינייםהפריןאוטולוגי זיהום הזנב כירורגי