השפעת מחסור בחמצן-גלוקוז וחמצון מחדש על אינטראקציות תא-תא

תקציר

מקור: Alluri, H., et.al. מחסור בחמצן-גלוקוז וחמצון מחדש כמודל במבחנה פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה לחקר תפקוד לקוי של מחסום דם-מוח. J. Vis. Exp. (2015).

הסרטון מדגים את ההשפעה של מחסור בחמצן-גלוקוז וחמצון מחדש לאחר מכן על תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח של חולדות (RBMECs) על ידי הדמיית מצבים היפוקסיים וחסרי חומרים מזינים. תנאים אלה גורמים לדלדול ATP, עלייה בסידן תוך תאי ויצירת מיני חמצן תגובתיים (ROS), אשר מפרקים חלבוני צומת תאים וגורמים להיווצרות סיבי עקה, ובכך מחלישים אינטראקציות תא-תא.

פרוטוקול

1. זריעה של תאי אנדותל

1. להשיג תרביות ראשוניות של RBMECs מחולדות ספראג דולי בוגרות (או להשיג אותן באופן מסחרי).

2. טפחו RBMECs בצלחות פטרי מצופות פיברונקטין בגודל 100 ס"מ (50 מיקרוגרם/מ"ל) באמצעות מדיום גידול תאי האנדותל של מוח העכברוש. שנה את המדיום כל יומיים עד שמגיעים למפגש.

3. בהגעה למפגש של 80-90%, יש לשטוף בעדינות את התאים במי מלח חוצץ פוספט (PBS) של 5 מ"ל על ידי מערבולת. לאחר מכן מנתקים את התאים על ידי חשיפתם ל-1 מ"ל של תמיסת חומצה חמה של 0.25% טריפסין-אתילנדיאמין-טטראצטית (EDTA), מאוזנת ל-37 מעלות צלזיוס.

4. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 2-5 דקות עד שהתאים מנותקים ומתפזרים. הערה: הקש על צלחת התרבית כדי לנתק את התאים. הצג תאים מתחת למיקרוסקופ כדי לאשר ניתוק מוחלט של תאים מפני השטח של הצלחת.

5. מוסיפים 5 מ"ל מדיה שלמה לצלחת הפטרי על מנת לנטרל טריפסין. הוצא את המדיום המכיל תאים מנותקים ואסוף אותו לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.

6. צנטריפוגה של המדיה המכילה תאי אנדותל ב-220 x g למשך 5 דקות.

7. שאפו את הסופרנטנט ושמרו על התאים המכילים גלולה. השעו את הגלולה לתוך 3-5 מ"ל מדיום גידול תאי אנדותל טריים של מוח חולדה על ידי ערבוב עדין למעלה ולמטה עם פיפטה. לאחר מכן התאים ייספרו באמצעות מונה תאים אוטומטי או המוציטומטר.

8. העבירו את תרחיף התאים לפיברונקטין (50 מיקרוגרם/מ"ל) מערכת החלקה סטרילית מצופה מראש עם 8 בארות, 0.7 מ"ר. ס"מ/באר עם צפיפות זריעה הנעה בין 10,000-15,000 תאים לבאר. יש לגדל את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד להשגת מפגש הערה: לביצוע כתמים מערביים או ניסויים אחרים, ניתן לגדל תאים בכלי תרבית תאים בגודל 10 ס"מ או בכלים מיוחדים לפי דרישת הניסוי.

2. מחסור בחמצן וגלוקוז במודל מבחנה

1. השתמשו במערכת תרבית תאי היפוקסיה כדי לחקור את ההשפעות של OGD-R על RBMECs (ראו ). הגדירו וכילו את מערכת תרבית תאי ההיפוקסיה לפני תחילת הניסוי, בהתאם להוראות היצרן.

2. הסר את מגלשות התא המשולב (שלב 1.8) מהחממה של 37 מעלות צלזיוס. החלף את המדיום השלם במגלשת התא במדיום הנשר המותאם של דולבקו (DMEM) נטול חמצן, ללא גלוקוז, והוצב בתא היפוקסיה עם 95% חנקן ו-5% פחמן דו חמצני למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס, כדי לייצג את מצב OGD.

3. העבר את התאים בחזרה לאינקובטור עם 95% חמצן, 5% פחמן דו חמצני ב-37 מעלות צלזיוס ומסופק עם תא אנדותל טרי של מוח חולדה מדיום שלם ודגירה למשך שעה נוספת ב-37 מעלות צלזיוס.

} הערה: שלב זה מייצג מצב של חמצון מחדש.

תוצאות

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Proox model 110	Biospherix	Model 110
DMEM, no glucose	Gibco, Life technologies	11966-025
Rhodamine Phalloidin	Life technologies	R415
ZO-1 ארנב Polyclonal	Antibody Life technologies	617300
Nunc Lab Tek II-CC 8 well sterile, glass slides	Thermo scientific	177402
FITC-tagged anti-rabbit secondary נוגדן	סנטה קרוז	SC-2090
DPBS 1X	Thermo scientific	SH 30028.03	ניתן להשתמש בכל PBS אחר זמין