כרומטין מקורי אימונו-משקעים של תאי נוירוספרה

תקציר

מקור: Mendez, F. M. et al., Native Chromatin immunoprecipitation using Moine Tumor Tumor Neurospheres. J. Vis. exp. (2018).

סרטון זה מדגים את הבידוד של קומפלקסים של חלבון-DNA מתאי נוירוספרה שמקורם בגידול מוח של עכבר באמצעות משקעים חיסוניים מקוריים של כרומטין. הוא מפרט את השלבים להכנת כרומטין, משקעים חיסוניים, שטיפה ועיכול חלבון לשחרור DNA לניתוח במורד הזרם.

פרוטוקול

1. כרומטין מקומי (ChIP)

1. }הכנת כרומטין
   1. } לאחר ביצוע מלאי של תאי נוירוספרה נגזרים (NS), תרבית NS בבקבוק T-75 ב-15 מ"ל של מדיום NSC ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרבית רקמה עם אטמוספירה של 95% אוויר ו-5% CO₂ עד ש-NS יתכנס. לוחית T-75 מתכנסת אחת תניב 3-5 X 10⁶ תאים.
   2. כאשר התאים מתכנסים, צנטריפוגה NS ב-300 x גרם למשך 5 דקות, מוציאים את הסופרנטנט ומוסיפים 1 מ"ל של מדיום דיסוציאציה של תאים. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. הוסף 5 מ"ל מדיום וספור את התאים באמצעות המוציטומטר.
      הערה: 1 x 10⁶ תאים דרושים לכל תגובת משקעים חיסוניים (IP). שימו לב כי יש לכלול גם סרום טרום חיסוני או בקרת IgG.
   3. צנטריפוגה את ה-NS בצינור מיקרו-צנטריפוגה אחד של 1.5 מ"ל ב-300 x גרם למשך 5 דקות, שפכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור ה-NS עם 1 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת והעבירו את התרחיף לצינורות מיקרו-צנטריפוגה נמוכים של 1.5 מ"ל.
   4. צנטריפוגה NS ב-300 x גרם למשך 5 דקות, מרוקנת את הסופרנטנט ומשהה מחדש את כדורית התא ב-95 מיקרוליטר של מאגר עיכול (50 מ"מ Tris-HCl, pH 8.0, 1 מ"מ CaCl₂, 0.2% פוליאתילן גליקול אוקטילפניל אתר) לכל 1 x 10⁶} תאים בתוספת קוקטייל מעכב פרוטאז בריכוז גבוה (1:100). צנרת מיד את התאים למעלה ולמטה כדי למנוע גושים ולהימנע מיצירת בועות.
   5. השהה מחדש את המיקרוקוק נוקלאז (MNase) ב-50% גליצרול כדי ליצור תמיסה של 1 מ"ג/מ"ל (1.15 יחידות/מיקרוליטר, מאוחסנת ב-20 מעלות צלזיוס) שתיקרא מלאי "1x". הכינו מלאי "0.1x" על ידי ביצוע דילול שני של 1:9 עם 50% גליצרול ( למשל., 900 מיקרוליטר של "1x" MNase ו-100 מיקרוליטר של 50% גליצרול) ואחסנו אותו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
   6. מערבבים 5 מיקרוליטר של "0.1x" MNase ו-145 מיקרוליטר של מאגר עיכול. שמור את האנזים על קרח כל הזמן. הוסף 5 מיקרוליטר של MNase מדולל במאגר העיכול לכל 1 x 10⁶ תאים. יש לערבב את הצינור ולהניח את הצינור בבלוק של 37 מעלות צלזיוס למשך 12 דקות בדיוק. עבד את הדגימות אחת בכל פעם כדי להבטיח זמן דגירה מדויק של 12 דקות.
   7. הוסף 10 מיקרוליטר של 10x MNase Stop Buffer (110 מ"מ Tris-HCl, pH 8.0, 55 מ"מ חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)) לכל 1 x 10⁶ תאים. יש לשמור דגימות על קרח מנקודה זו ואילך.
   8. הוסף 110 מיקרוליטר "2x מאגר מאגר בדיקת משקעים רדיו-אימונו-משקעים (RIPA)" (280 מ"מ NaCl, 1.8% פוליאתילן גליקול אוקטילפניל אתר, 0.2% נתרן דודציל סולפט (SDS), 0.2% Na-דאוקסיכולאט, 5 מ"מ אתילן גליקול-ביס (אתר β-אמינואתיל)-N,N,N',N'-חומצה טטראצטית (EGTA); מאוחסן ב-4 מעלות צלזיוס) בתוספת קוקטייל מעכב פרוטאז בריכוז גבוה (1:100) לכל 1 x 10⁶ תאים. יש לערבב את השפופרת כדי לערבב.
   9. צנטריפוגה את הצינורות למשך 15 דקות במיקרופוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ו-1700 x גרם. העבירו את הסופרנטנט לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה רגילה חדשה של 1.5 מ"ל (אין עוד צורך בצינורות מיקרו-צנטריפוגה קושרים חלבון נמוך) ואחסנו אותם על קרח. השלך את הגלולה.
      
2. Immunoprecipitation (IP)
   1. ערבבו חרוזים מגנטיים של חלבון A וחלבון G ביחס של 1:1. לכל IP, הכינו 25 מיקרוליטר חרוזים.
   2. שטפו את החרוזים על ידי הוספת 1 מ"ל של חוצץ RIPA (10 מ"מ Tris pH 8.0, 1 מ"מ EDTA, 140 מ"מ NaCl, 1% פוליאתילן גליקול אוקטילפניל אתר, 0.1% SDS, 0.1% Na-deoxycholate; מאוחסן ב-4 מעלות צלזיוס) בתוספת מעכבי פרוטאז בריכוז נמוך (1:1000).
   3. השתמש במגנט כדי לאפשר לחרוזים להיפרד מתמיסת הכביסה ולשפוך את תמיסת הכביסה (כדקה אחת). בצע את שלב הכביסה פעמיים.
   4. השעו מחדש את החרוזים לנפח המקורי באמצעות מאגר RIPA בתוספת מעכבי פרוטאז (1:1000).
   5. במידת הצורך, יש לדלל את הכרומטין באמצעות מאגר RIPA בתוספת מעכבי פרוטאז (1:1000) כך שלכל IP יהיה נפח של 100-200 מיקרוליטר. שמור 10% מהנפח המשמש לכל IP של כרומטין לקלט.
      הערה: לדוגמה, אם משתמשים ב-200 מיקרוליטר לכל IP, יש לשמור 20 מיקרוליטר של כרומטין מדולל לקלט. בסך הכל ארבע כתובות IP, יש לדלל את נפח הכרומטין הכולל ל-820 מיקרוליטר.
   6. הכן את הקלט. הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר TE (10 מ"מ Tris-HCl pH 8.0, 1 מ"מ EDTA) בתוספת פרוטאינאז K (0.5 מ"ג/מ"ל) לכניסה ודגר את הקלט ב-55 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.
   7. טהר את הקלט באמצעות ערכת טיהור תגובת שרשרת פולימראז (PCR) בהתאם להוראות היצרן והוציא פנימה 50 מיקרוליטר של מאגר פליטה המסופק בערכה.
   8. מדוד את ריכוז הקלט באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח ורשום את התוצאות במחברת. ריק עם מאגר פליטה מהערכה.
      הערה: בנוירוספרות של עכברים, השתמשנו בכ-6 מיקרוגרם של דנ"א עבור כל IP.
   9. הפעל קלט על ג'ל של 1% או טען 1 מיקרוליטר על ביואנלייזר DNA באמצעות הגדרות סטנדרטיות. אחסן את השאר לשימוש כקלט ביישומים במורד הזרם.
   10. הוסף 10 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים של חלבון שטוף A ו-G עבור כל IP ודגר IP למשך שעה אחת ב-4 מעלות צלזיוס.
       } הערה: לדוגמה, הוסף 30 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים של חלבון A ו-G עבור שלושה IP.
   11. הניחו את הדגימות על מגנט ואפשרו לחרוזים להיפרד. חלקו כרומטין על ידי העברת הכמות שנקבעה בעבר לצינור חדש של 1.5 מ"ל.
   12. מוסיפים את הנוגדן ועוטפים את הכובעים בסרט פרפין מפלסטיק כדי למנוע אידוי. דגרו את הדגימות למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס עם סיבוב ב-20 סל"ד.
       הערה: יש לקבוע את הריכוז באופן אמפירי בהתאם להמלצות היצרן.
   13. למחרת, סובב את הצינורות באמצעות מיני צנטריפוגה בטמפרטורת החדר, 2000 x גרם, למשך 10 שניות. לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר חרוזים לכל IP ודגר IP למשך 3 שעות ב-4 מעלות צלזיוס עם סיבוב ב-20 סל"ד.
       
3. שטיפת IP ועיכול חלבונים
   1. הוסף 150 מיקרוליטר של מאגר RIPA בתוספת מעכבי פרוטאז בריכוז נמוך (1:1000) לכל IP ודגר IP ב-4 מעלות צלזיוס עם סיבוב ב-20 סל"ד למשך 5 דקות. הנח את הדגימה על מעמד מגנטי ואפשר לחרוזים המגנטיים להיפרד. השתמש בפיפט כדי להסיר את הסופרנטנט. חזור על שלב זה חמש פעמים.
   2. הוסף 150 מיקרוליטר של חוצץ ליתיום כלוריד (LiCl) (250 מ"מ LiCl, 10 מ"מ Tris pH 8.0, 1 מ"מ EDTA, 0.5% NP-40, 0.5% Na-deoxycholate; יש לאחסן ב-4 מעלות צלזיוס) בתוספת מעכבי פרוטאז בריכוז נמוך (1:1000) לכל IP ולדגור IP ב-4 מעלות צלזיוס עם סיבוב ב-20 סל"ד למשך 5 דקות. הנח את הדגימה על מעמד מגנטי ואפשר לחרוזים מגנטיים להיפרד. השתמש בפיפט כדי להסיר את הסופרנטנט.
   3. הוסף 150 מיקרוליטר של Tris-EDTA קר (TE) (ללא מעכבי פרוטאז) ודגר את הדגימה ב-4 מעלות צלזיוס עם סיבוב ב-20 סל"ד למשך 5 דקות. הנח את הדגימה על מעמד מגנטי ואפשר לחרוזים מגנטיים להיפרד. השתמש בפיפט כדי להסיר את הסופרנטנט.
   4. לאחר שלב הכביסה האחרון, יש להשהות מחדש את הדגימה ב-100 מיקרוליטר של מאגר TE בתוספת פרוטאינאז K (0.5 מ"ג/מ"ל) ולדגור את הדגימה ב-55 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent	G2946-90004	bioanalyzer
AccuSpin Micro 17R, קירור	Fisher Scientific	13-100-676
C57BL/6	Taconic	B6-f	C57BL/6 עכבר
Calcium Chloride	Aldrich	22350-6	buffer reagent
D-לוציפרין, מלח אשלגן	Goldbio	LuckK-1g
DiaMag1.5 magnetic rack	Diagenode	B04000003	לשטיפות חרוזים מגנטיות
DiaMag Rotator EU	Diagenode	B05000001	מסובב
DMEM/F-12	Gibco	11330-057	NSC component
Dynabeads Protein A	Thermo Fisher Scientific	10001D	חלבון A חרוזים מגנטיים
Dynabeads Protein G	Thermo Fisher Scientific	10003D	protein G magnetic beads
EGF	PeproTech	AF-100-15	הכינו מלאי של 20 מיקרוגרם/מ"ל ב-0.1% BSA ו-aliquot.
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)<	E-4884	buffer reagent
אתילן גליקול-ביס(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-חומצה טטראצטית) (EGTA)	Sigma	E-4378	מגיב מאגר
Fetal Bovine Serum	Gibco	10437028	להקפאת תאים<
FGF	PeproTech	100-18b	הכן מלאי של 20 מיקרוגרם/מ"ל ב-0.1% BSA ו-aliquot.
Forceps	Fine Science Tools	11008-13	for dissection of tumor
גליצרול, MB Grade	EMD- Millipore	356352
HBSS	Gibco	14175-103	balanced salt solution
Fluriso	VETone	501017	הרדמה בשאיפה
Ivis Spectrum	Perkin-Elmer	124262	מערכת הדמיה אופטית in vivo
Hyqtase	HyClon	SV3003001	מדיית ניתוק תאים
Lithium Chloride	Sigma	L8895	buffer reagent
מיקרו-צינורות כריכה נמוכים	Corning Costar	CLS3207	נמוך צינור מיקרוצנטריפוגה מחייב חלבון
צינור מיקרוצנטריפוגה	פישר	21-402-903	צינור מיקרו-צנטריפוגה רגיל
Micrococcal Nuclease	Thermo Fisher Scientific, Affymetrix	70196Y	כל אצווה עשויה להיות שונה; לרכוש כמות מספקת לניסויים ו- aliquot.
N2	Gibco	17502-048	NSC component
Normocin	Invivogen	NOL-36-063	חומר אנטי-מיקרוביאלי, שימוש ב-0.1 מ"ג/מ"ל.
NP-40 (Igepal CA-630)	Sigma	18896-50ML	buffer reagent
Kimble Kontes Pellet Pestle	Fisher Scientific	K749515-0000
קוקטייל מעכב פרוטאז<	P8340	aliquot ואחסן ב-20°C.
Protinase K	Sigma-Aldrich	P2308	make מלאי של 10 מ"ג/מ"ל במים; יש לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס.
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	DNA purification kit
אזמל	כלי מדע עדינים	10007-16	for dissection of tumor
נתרן כלורי<	0241-5KG	מגיב מאגר
Sodium Deoxycholate	Sigma-Aldrich	D670-25G	buffer reagent
נתרן דודציל סולפט (SDS)	Sigma	L-4390	buffer reagent
Tris Base	Thermo Fisher Scientific	Bp152-1	buffer reagent
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	BP 151-500	פוליאתילן גליקול octylphenyl ether
צנטריפוגה מיני סטנדרטית	Fisherbrand	12-006-901	צנטריפוגה מיני סטנדרטית
SZX16 microscope	Olympus	SZX16	fluorescent dissecting microscope
Nanodrop One	Thermo-Fisher Scientific	ND-ONEC-W

style='height:19px;' >td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Sigmatr style='גובה:19px;'>td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Sigma-Aldrichtd style='גבול-תחתון:1px מוצק #000000;גבול-ימין:1px מוצק #000000;גלישה:מוסתר;ריפוד:0px 3px;יישור אנכי:תחתון;'>VWR