ביצוע הכלאה של פלואורסצנציה כפולה באתרה לאיתור ביטוי גנים במקטעי מוח של עכבר

תקציר

מקור: Jolly, S., et.al. שילוב של פלואורסצנציה כפולה בהכלאה באתר עם תיוג חיסוני לזיהוי ביטוי של שלושה גנים במקטעי מוח של עכברים. J. Vis. Exp. (2016).

סרטון זה מדגים את השימוש בפלואורסצנציה כפולה בהכלאה באתרה כדי לדמיין את הביטוי של שתי מטרות RNA במקטעי מוח של עכברים. הפרוטוקול כולל זיהוי רציף של RNA באמצעות בדיקות המסומנות בפלואורסצאין איזותיוציאנט ודיגוקסיגנין, ואחריו הגברת אות אנזימטית להגברת הרגישות. הקרינה המתקבלת מאפשרת ניתוח לוקליזציה משותפת של רנ"א המטרה בתוך הרקמה.

פרוטוקול

כל ההליכים הקשורים לדגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לביקורת אתית של בעלי חיים.

1. הכלאה

1. הכינו מאגר כביסה של 65 מעלות צלזיוס: 150 מ"מ NaCl, 15 מ"מ Na₃C₃H₅O(COO)₃ (= 1x נתרן ציטראט מלוח), 50% (v/v) פורממיד ו-0.1% (v/v) Tween-20.
2. הכן מאגר MABT: 100 מ"מ חומצה מאלית, 150 מ"מ NaCl, 0.1% (v/v) Tween-20, pH 7.5.
3. לדלל את שני הבדיקות (עם תווית DIG ועם תווית FITC) 1/1,000 במאגר הכלאה (מים נטולי יונים שטופלו ב-DEPC עם 50% (v/v) פורממיד נטול יונים, 200 מ"מ NaCl, 5 מ"מ EDTA, 10 מ"מ Tris-HCl pH 7.5, 5 מ"מ NaH₂PO₄, 5 מ"מ Na₂HPO₄, 0.01 מ"ג/מ"ל tRNA שמרים, 1× תמיסת דנהרדט ו-10% w/v דקסטרן סולפט) מחוממים מראש ל-65 מעלות צלזיוס ומערבבים היטב.
4. מרחו כ-300 מיקרוליטר של תערובת הכלאה על כל שקופית, כיסו עם כיסויים אפויים בתנור (200 מעלות צלזיוס) ודגרו O/N ב-65 מעלות צלזיוס בתא לח.
5. מעבירים את השקופיות לצנצנת קופלין המכילה מאגר כביסה מחומם מראש. שטפו את השקופיות במשך 30 דקות פעמיים בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס עם מאגר כביסה.
6. שטפו את השקופיות במשך 10 דקות שלוש פעמים עם MABT ב-RT.

2. ויזואליזציה של בדיקת FITC

1. הכן מאגר חסימת ISH: MABT עם 2% מגיב חוסם ו-10% נסיוב כבשים מושבת בחום.
2. אופציונלי: השתמש בעט הידרופובי כדי לצייר עיגולים סביב חלקי הרקמה בשקופית כדי להפחית את נפח תמיסות הנוגדנים הנדרשות.
3. דגרו את המגלשות למשך שעה אחת ב-RT עם מאגר חוסם ISH בתא לח.
4. דגרו את המגלשות O/N ב-4 מעלות צלזיוס עם פרוקסידאז חזרת (POD) - נוגדן מצומד נגד FITC מדולל 1/500 (v/v) במאגר חוסם ISH.
5. הנח את השקופיות בצנצנת קופלין המכילה PBS עם 0.1% (v/v) Tween-20 (PBST). יש לשטוף 3 פעמים למשך 10 דקות ב-PBST ולהחליף ב-PBST טרי בכל פעם.
6. מיד לפני השימוש, הכינו את הטירמיד הפלואורסצנטי על ידי דילול 100 פעמים לתוך מדלל ההגברה. בדוגמה זו, השתמש ב-FITC-tyramide.
7. הוסיפו את זה לשקופיות והשאירו למשך 10 דקות ב-RT.
8. הניחו את השקופיות בצנצנת קופלין ושטפו 3 פעמים ב-PBST למשך 10 דקות.

3. ויזואליזציה של בדיקת DIG

1. הכן 0.1 מ' Tris- HCl pH 8.2.
2. דגרו את השקופיות עם מאגר חוסם ISH למשך שעה אחת ב-RT.
3. דגרו את השקופיות O/N ב-4 מעלות צלזיוס עם פוספטאז אלקליין (AP) -נוגדן מצומד נגד DIG מדולל 1/1,500 (v/v) במאגר חוסם ISH.
4. יש לשטוף עם MABT למשך 10 דקות שלוש פעמים.
5. יש לשטוף פעמיים עם 0.1 M Tris-HCl pH 8.2 למשך 5 דקות ב-RT.
6. מיד לפני השימוש, הכינו תמיסה אדומה מהירה על ידי המסת הטבליות ב-0.1 M Tris pH 8.2. מסננים את התמיסה דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר.
7. דגרו את המגלשות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם תמיסה אדומה מהירה בתא לח. ככל שהזמן להתפתחות אופטימלית משתנה, בדוק את השקופיות באופן קבוע במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לעקוב אחר היווצרות המשקעים. בדוגמה זו, עצרו את התגובה לאחר 2-3 שעות.
8. שטפו עם PBST למשך 10 דקות שלוש פעמים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Superfrost plus slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Sodium citrate	Sigma	S4641	עבור מאגר כביסה של 65 מעלות צלזיוס
Formamide	Sigma-Aldrich	F7503		Tween-20
Sigma-Aldrich	P1379
Coverslips	VWR International	631-0146
Coplin Jar	Smith Scientific Ltd	2959
מגיב חוסם	Roche	11096176001
נסיוב כבשים מושבת בחום	Sigma	S2263	<
Cosmo Bio	DAI-PAP-S	09:20
α-FITC POD-conjugated antibody	Roche	11426346910
TSA™ Plus Fluorescein System	Perkin Elmer	NEL741001KT	26:00:00<
Roche	11093274910
Fast red Tablets	Roche	11496549001
Mounting medium	Dako	S3023
Leica SP2 confocal microscope	Leica
.22 μM filter	Millex	SLGP033RS
formamide Deionized	Sigma	F9037	עבור מאגר חסימת ISH
נתרן כלורי <	S3014
חומצה הידרוכלורית	VWR International	20252.29
נתרן פוספט מונו-בסיסי נטול מים	Sigma	S8282
נתרן פוספט dibasic dihydrate	Sigma	30435
שמרים tRNA	Roche	10109495001
50x הפתרון של דנהרדט	Life Technologies	750018
Dextran sulfate	Sigma	D8906
נתרן אצטט	Sigma	S2889
Trizma Base	Sigma	T1503

td style='border-top-style:none;height:15.75pt;width:221pt;'>Hydrophobic pentd style='border-top-style:none;height:15.75pt;width:221pt;'>α-DIG AP-conjugatedtd style='border-left-style:none;border-top-style:none;'>Sigma