צביעה אימונופלואורסצנטית של רקמה פיברווסקולרית חולה שמקורה בחולה משובצת בג'ל

תקציר

מקור: Gucciardo, E., et. al., מודל תרבית רקמות ex vivo לסיבוכים פיברווסקולריים ברטינופתיה סוכרתית פרוליפרטיבית. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מפרט פרוטוקול צביעה חיסונית עבור תרביות ex vivo של רקמה פיברווסקולרית המוטמעת בג'ל פיברין. זה מאפשר הדמיה מפורטת של שינויים בכלי הדם הקשורים לרטינופתיה סוכרתית פרוליפרטיבית

פרוטוקול

כל ההליכים הקשורים לאיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות ה-IRB של המכון.

1. צביעה אימונופלואורסצנטית שלמה

הערה: פרוטוקול זה נמשך 5 ימים וניתן להפסיק אותו עם דגירה לילית היכן שמצוין. אל תתנו לג'לי הפיברין להתייבש בשום שלב. כל השלבים מבוצעים ב-RT אלא אם צוין אחרת.

1. הכן את הפתרונות הבאים לפני שתתחיל בפרוטוקול הצביעה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Material
לוחות תרבית תאים, 96-well, U-bottom	Greiner Bio-One	392-0019	משמש לאימונופלואורסצנציה
מרית עגולה/שטוחה, נירוסטה	VWR	82027-528	משמש לאימונופלואורסצנציה שלמה
כיסויים 22x22 מ"מ #1	Menzel/Fisher	15727582	משמש להרכבה
Microscope slides	Fisher	Kindler K102	משמש להרכבה
נייר סופג	VWR	115-0202	משמש להרכבה
PBS tablets	Medicago	09-9400-100	משמש להכנת 1x PBS
Acetone	Sigma-Aldrich	32201-2.5L-M	משמש להכנת הפתרון שלאחר הקיבוע. מזיק: ללבוש כפפות ו/או ביגוד מגן. השתמש במכסה אדים.
Methanol	Sigma-Aldrich	32213	משמש להכנת הפתרון שלאחר הקיבוע. רעיל: ללבוש כפפות ו/או ביגוד מגן. השתמש במכסה אדים.
Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate)	Sigma-Aldrich	T9284	משמש לאימונופלואורסצנציה שלמה. מזיק: ללבוש כפפות ו/או ביגוד מגן.
Hoechst 33342, 20mM	Life Technologies	62249	עבור צביעה נגדית של גרעינים. מזיק: ללבוש כפפות מגן ו/או ביגוד, והגנה על העיניים ו/או הפנים.
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	ללבוש כפפות מגן ו/או ביגוד, והגנה על העיניים. השתמש במכסה אדים.
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200	מדיום הרכבה עם כתמים נגדיים של גרעינים. ללבוש כפפות ו/או ביגוד מגן, והגנה על העיניים. השתמש במכסה אדים.
Eukitt הרכבה מתקשה במהירות	Sigma-Aldrich	03989-100ml	TOXIC: ללבוש כפפות מגן ו/או בגדים, והגנה על העיניים. השתמש במכסה אדים.
VEGFA	='width:174pt;'>מערכות מו"פ	293-VE-010	50 ng/ mL ריכוז
recombinant human VEGFC	R&D Systems	752-VC-025	200 ng/ mL ריכוז סופי
TGFβ	='רוחב:174pt;'>Millipore	GF346	1 ng/ mL ריכוז
recombinant human bFGF	Millipore	01-106	50 ng/ mL ריכוז
CD31 (JC70A)	Dako	M0823	בשימוש בדילול של 1:100, חמור אנטי עכבר Alexa 488 משני Ab
CD34 (QBEND10)	Dako	M716501-2	בשימוש בדילול של 1:100, חמור אנטי עכבר Alexa 488 משני Ab
CD45 (2B11+PD7/26)	Dako	M070129-2	בשימוש בדילול של 1:100, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD68	ImmunoWay	RLM3161	בשימוש בדילול של 1:100, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
Cleaved caspase-3 (5A1E)	איתות תאים	9664	בשימוש בדילול של 1:200, עז אנטי ארנב Alexa 594 משני Ab
ERG (EP111)	Dako	M731429-2	בשימוש בדילול של 1:100, עז אנטי ארנב Alexa 594 משני Ab
GFAP	Dako	Z0334	בשימוש בדילול של 1:100, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Ki67	Leica Microsystems	NCL-Ki67p	בשימוש בדילול של 1:1500, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Lyve1	R&D Systems	AF2089	בשימוש בדילול של 1:100, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab
NG2	Millipore	AB5320	בשימוש בדילול של 1:100, עז אנטי ארנב Alexa 594 משני Ab
Prox1	ReliaTech	102-PA32	בשימוש בדילול של 1:200, עז אנטי ארנב Alexa 568 Secondary Ab
Prox1	R&D Systems	AF2727	בשימוש בדילול של 1:40, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab
VEGFR3 (9D9F9)	Millipore	MAB3757	בשימוש בדילול של 1:100, דונקי אנטי עכבר Alexa 488 משני Ab
α-SMA (1A4)	Sigma	C6198	בשימוש בדילול של 1:400, Cy3 מצומד
Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG	Life Technologies	A-21202	בשימוש בדילול
Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG	Invitrogen	A-11012	בשימוש בדילול
Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG	Thermo	A-11057	בשימוש בדילול של 1:500
Alexa Fluor568 עז אנטי-ארנב IgG	Thermo Scientific	A-11036	בשימוש בדילול של 1:500	Alexa Fluor594 עוף נגד עזים IgG	בדיקות מולקולריות
A-21468	בשימוש בדילול של 1:500
Name	Company	Catalog Number	Comments	Microscopes				מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי הפוך Axiovert 200	Zeiss		להדמיה של ה-FT
AxioImager.Z1 מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי זקוף עם Apotome	Zeiss		להדמיה של FT מוכתם חיסוני שלם

שלמה סופי סופי סופי של 1:500 של 1:500