צביעה אימונופלואורסצנטית של רקמה פיברווסקולרית חולה שמקורה בחולה משובצת בג'ל

תקציר

מקור: Gucciardo, E., et. al., מודל תרבית רקמות ex vivo לסיבוכים פיברווסקולריים ברטינופתיה סוכרתית פרוליפרטיבית. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מפרט פרוטוקול צביעה חיסונית עבור תרביות ex vivo של רקמה פיברווסקולרית המוטמעת בג'ל פיברין. זה מאפשר הדמיה מפורטת של שינויים בכלי הדם הקשורים לרטינופתיה סוכרתית פרוליפרטיבית

פרוטוקול

כל ההליכים הקשורים לאיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות ה-IRB של המכון.

1. צביעה אימונופלואורסצנטית שלמה

הערה: פרוטוקול זה נמשך 5 ימים וניתן להפסיק אותו עם דגירה לילית היכן שמצוין. אל תתנו לג'לי הפיברין להתייבש בשום שלב. כל השלבים מבוצעים ב-RT אלא אם צוין אחרת.

1. הכן את הפתרונות הבאים לפני שתתחיל בפרוטוקול הצביעה.
   1. פתרון לאחר הקיבוע: הכינו 50:50 אצטון:תמיסת מתנול על ידי ערבוב כמויות שוות של אצטון ומתנול ( למשל, 50 מ"ל). יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. יש להכין תמיסה זו לכל המאוחר ביום שלפני הצביעה. ניתן לאחסן תמיסה זו בחזרה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס ולהשתמש בה לכתמים הבאים.
      הערה: הכן תמיסה זו במכסה אדים מכיוון שאצטון ומתנול דליקים ומסוכנים לבריאות.
   2. פתרון חוסם: הכינו תמיסת סרום בקר עוברי 15% (FBS), 0.3% אוקטיל פנול אתוקסילט ב-PBS על ידי הוספה ראשונה של 15% FBS ל-PBS. יש להוסיף אוקטיל פנול אתוקסילט ולערבב עד להתמוססות. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: ניתן להכין תמיסה זו בכמויות גדולות מראש, לאחסן אותה ב-15 מ"ל בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס, ולהפשיר לפני השימוש ביום תחילת פרוטוקול הצביעה. השתמש בכמויות טריות שהוכנו או הופשרו טריים עבור כל פרוטוקול צביעה.
   3. תמיסת כביסה: הכינו 1 ליטר PBS בתוספת 0.45% אוקטיל פנול אתוקסילט על ידי הוספת 4.5 מ"ל אוקטיל פנול אתוקסילט ל-995.5 מ"ל PBS. יש לערבב עד להתמוססות. אחסן ב-RT.
2. הרם את הטיפות בזהירות מהצלחת באמצעות מרית נירוסטה מרובעת. נתק תחילה את הטיפה מהקצוות לפני הרמת המרכז, והעביר לבאר של צלחת 12 בארות המכילה 1 מ"ל PBS.
   הערה: בצע שלבים לאחר קיבוע, שטיפות וחסימה בפורמט צלחת זה.
3. לאחר תיקון הטיפות עם 1 מ"ל של תמיסת אצטון: מתנול קרה כקרח 50:50 למשך ~1 דקה (גבול הטיפות יהפוך ללבן).
   הערה: בצע שלב זה במכסה המנוע מכיוון שאצטון ומתנול מסוכנים לבריאות.
4. יש לשטוף עם 3 - 5 כביסות ב -2 מ"ל PBS (הטיפות ישקעו בתמיסת PBS בסיום ההתייבשות).
   הערה: הימנע מלגעת בטיפות עם קצה הפיפטה מכיוון שלאחר הקיבוע הן דביקות לפלסטיק. לאורך כל הפרוטוקול, הימנע משאיבת תמיסות לאחר תיקון, נוגדנים, חסימה ושטיפה על ידי יניקה, מכיוון שהדבר עלול לפגוע או להרוס לחלוטין את הטיפות. במקום זאת, הטה את הצלחת והסר בזהירות תמיסות באמצעות פיפטה של 500-5,000 מיקרוליטר.
5. צנטריפוגה את תמיסת החסימה למשך 15 דקות ב-21,000 x g ו-4 °C על מנת להסיר פסולת.
   הערה: ניתן לצטט את התמיסה בצינורות של 1.5 מ"ל לצנטריפוגה. ניתן לאחסן את התמיסה שאינה בשימוש בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ולהשתמש בה לכל השלבים הבאים הרלוונטיים.
6. דגרו את הטיפות בתמיסת חסימה של 500 מיקרוליטר למשך שעתיים ב-RT.
   הערה: כדי להפחית את נפח תמיסת החסימה בשימוש, ניתן להטות את הצלחת על תומך ולהשתמש ב-300 מיקרוליטר של תמיסה/טיפה.
7. יש להכין את תערובת הנוגדנים העיקרית (לפחות 30 מיקרוליטר/טיפה) בדילול מתאים בתמיסה חוסמת ובצנטריפוגה למשך 15 דקות בטמפרטורה של 21,000 x גרם ו-4 מעלות צלזיוס.
8. מעבירים את הטיפות לצלחת עגולה (U)-תחתונה של 96 בארות באמצעות מרית עגולה, ודוגרים עם לפחות 30 מיקרוליטר/טיפה של תערובת הנוגדנים העיקרית למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.{{TAG_ 99}}
9. למחרת, העבירו את הטיפות לצלחת של 12 בארות המכילה 2 מ"ל של תמיסת כביסה/באר, שטפו תחילה בשלוש שטיפות של 5 דקות ולאחר מכן בתשע שטיפות של 30 דקות. השאירו את הכביסה האחרונה (2 מ"ל) למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
10. למחרת, שטפו שלוש פעמים עם PBS והעבירו את הטיפות לצלחת עגולה (U)-תחתונה של 96 בארות.
11. במהלך השטיפות, הכינו את תערובת הנוגדנים המשנית המתאימה מצומדת פלואורופור (מדוללת 1:500, לפחות 30 מיקרוליטר / טיפה) בתמיסה חוסמת וצנטריפוגה למשך 15 דקות ב-21,000 x גרם ו-4 מעלות צלזיוס.
12. העבירו את הטיפות לצלחת עגולה (U)-תחתונה של 96 בארות באמצעות מרית עגולה ודגרו עם לפחות 30 מיקרוליטר מתערובת הנוגדנים המשנית, למשך 4 שעות ב-RT, מוגן מפני אור.
    הערה: בצע את כל שלבי הדגירה והכביסה הבאים מוגנים מפני אור.
13. מעבירים את הטיפות לצלחת של 12 בארות המכילה 2 מ"ל תמיסת כביסה/באר בעזרת מרית עגולה, שוטפים תחילה בשלוש כביסות של 5 דקות ולאחר מכן בארבע כביסות של 30 דקות. השאירו את הכביסה האחרונה (2 מ"ל) למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
14. למחרת, שטפו את הג'לים בחמש שטיפות של 30 דקות ולאחר מכן שלוש פעמים עם PBS. השאירו את הכביסה האחרונה (2 מ"ל) למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
15. למחרת, העבירו את הטיפות לצלחת עגולה (U)-תחתונה של 96 בארות על ידי שימוש במרית עגולה וגרעיני כתמים נגדיים על ידי דגירה עם כתם גרעיני של 10 מיקרוגרם/מ"ל Hoechst (לפחות 30 מיקרוליטר/טיפה) למשך 30 דקות ב-RT.
    הערה: ניתן להשתמש במדיום הרכבה בתוספת 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) לצביעה נגדית של גרעינים. במקרה כזה, מדלגים על שלב זה ושלב 1.16, וממשיכים ישירות לשלב 1.17.
16. מעבירים את הטיפות לצלחת של 12 בארות המכילה 2 מ"ל PBS/באר בעזרת מרית עגולה ושוטפים שלוש פעמים עם PBS.
17. הרכיבו את הטיפות על שקופית המיקרוסקופ באופן הבא:
    1. מרחו שכבה צרה של אמצעי הרכבה מתקשה במהירות על שולי זכוכית כיסוי בצורת ריבוע בגודל 22 מ"מ על 22 מ"מ והניחו להתייבש למשך ~1 דקה. בצע שלב זה עבור כל טיפה בנפרד, כדי למנוע התקשות מוגזמת של אמצעי ההרכבה.
       הערה: בצע שלב זה במכסה המנוע מכיוון שאמצעי ההרכבה המתקשה במהירות מסוכן לבריאות.
    2. שוטפים את הטיפה על ידי טבילה בבאר של צלחת בת 12 בארות המכילה 2 מ"ל מים נטולי יונים ומעבירים למגלשת מיקרוסקופ, בעזרת מרית עגולה. הסר עודפי מים באמצעות פיסת נייר סופג קטנה.
    3. הוצא 15 מיקרוליטר של אמצעי הרכבה נגד דהייה שאינו מתקשה על הטיפה.
       הערה: לחלופין, אם לא נעשה שימוש בכתם גרעיני של הוכסט, ניתן להשתמש במדיום הרכבה המכיל 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI).
    4. מקם בעדינות את זכוכית הכיסוי, כאשר אמצעי ההרכבה המתקשה במהירות פונה למגלשה המיקרוסקופית, מעל הטיפה והניח להתייצב.
       הערה: המדיום המתקשה במהירות יידבק לשקופית המיקרוסקופית וישמור על הטיפה במקומה.
18. חזור על שלב 1.17 עבור כל הטיפות. הרכיבו שתי טיפות על כל שקופית מיקרוסקופ.
19. הניחו למגלשות להתייבש באוויר ב-RT למשך ~2 שעות ואחסנו ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. ודא שהשקופיות ממוקמות אופקית ומוגנות מפני אור.
20. דמיין את תרביות ה-FT ex vivo המוכתמות או בנקודת הקצה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי או מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי זקוף המצויד בפונקציית חתך אופטית ואובייקטיבית של פי 20 או פי 40. השתמש בפונקציית אריחים כדי ללכוד שטח גדול יותר של הרקמה בבת אחת.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Material
לוחות תרבית תאים, 96-well, U-bottom	Greiner Bio-One	392-0019	משמש לאימונופלואורסצנציה
מרית עגולה/שטוחה, נירוסטה	VWR	82027-528	משמש לאימונופלואורסצנציה שלמה
כיסויים 22x22 מ"מ #1	Menzel/Fisher	15727582	משמש להרכבה
Microscope slides	Fisher	Kindler K102	משמש להרכבה
נייר סופג	VWR	115-0202	משמש להרכבה
PBS tablets	Medicago	09-9400-100	משמש להכנת 1x PBS
Acetone	Sigma-Aldrich	32201-2.5L-M	משמש להכנת הפתרון שלאחר הקיבוע. מזיק: ללבוש כפפות ו/או ביגוד מגן. השתמש במכסה אדים.
Methanol	Sigma-Aldrich	32213	משמש להכנת הפתרון שלאחר הקיבוע. רעיל: ללבוש כפפות ו/או ביגוד מגן. השתמש במכסה אדים.
Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate)	Sigma-Aldrich	T9284	משמש לאימונופלואורסצנציה שלמה. מזיק: ללבוש כפפות ו/או ביגוד מגן.
Hoechst 33342, 20mM	Life Technologies	62249	עבור צביעה נגדית של גרעינים. מזיק: ללבוש כפפות מגן ו/או ביגוד, והגנה על העיניים ו/או הפנים.
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	ללבוש כפפות מגן ו/או ביגוד, והגנה על העיניים. השתמש במכסה אדים.
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200	מדיום הרכבה עם כתמים נגדיים של גרעינים. ללבוש כפפות ו/או ביגוד מגן, והגנה על העיניים. השתמש במכסה אדים.
Eukitt הרכבה מתקשה במהירות	Sigma-Aldrich	03989-100ml	TOXIC: ללבוש כפפות מגן ו/או בגדים, והגנה על העיניים. השתמש במכסה אדים.
VEGFA	='width:174pt;'>מערכות מו"פ	293-VE-010	50 ng/ mL ריכוז
recombinant human VEGFC	R&D Systems	752-VC-025	200 ng/ mL ריכוז סופי
TGFβ	='רוחב:174pt;'>Millipore	GF346	1 ng/ mL ריכוז
recombinant human bFGF	Millipore	01-106	50 ng/ mL ריכוז
CD31 (JC70A)	Dako	M0823	בשימוש בדילול של 1:100, חמור אנטי עכבר Alexa 488 משני Ab
CD34 (QBEND10)	Dako	M716501-2	בשימוש בדילול של 1:100, חמור אנטי עכבר Alexa 488 משני Ab
CD45 (2B11+PD7/26)	Dako	M070129-2	בשימוש בדילול של 1:100, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD68	ImmunoWay	RLM3161	בשימוש בדילול של 1:100, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
Cleaved caspase-3 (5A1E)	איתות תאים	9664	בשימוש בדילול של 1:200, עז אנטי ארנב Alexa 594 משני Ab
ERG (EP111)	Dako	M731429-2	בשימוש בדילול של 1:100, עז אנטי ארנב Alexa 594 משני Ab
GFAP	Dako	Z0334	בשימוש בדילול של 1:100, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Ki67	Leica Microsystems	NCL-Ki67p	בשימוש בדילול של 1:1500, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Lyve1	R&D Systems	AF2089	בשימוש בדילול של 1:100, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab
NG2	Millipore	AB5320	בשימוש בדילול של 1:100, עז אנטי ארנב Alexa 594 משני Ab
Prox1	ReliaTech	102-PA32	בשימוש בדילול של 1:200, עז אנטי ארנב Alexa 568 Secondary Ab
Prox1	R&D Systems	AF2727	בשימוש בדילול של 1:40, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab
VEGFR3 (9D9F9)	Millipore	MAB3757	בשימוש בדילול של 1:100, דונקי אנטי עכבר Alexa 488 משני Ab
α-SMA (1A4)	Sigma	C6198	בשימוש בדילול של 1:400, Cy3 מצומד
Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG	Life Technologies	A-21202	בשימוש בדילול
Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG	Invitrogen	A-11012	בשימוש בדילול
Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG	Thermo	A-11057	בשימוש בדילול של 1:500
Alexa Fluor568 עז אנטי-ארנב IgG	Thermo Scientific	A-11036	בשימוש בדילול של 1:500	Alexa Fluor594 עוף נגד עזים IgG	בדיקות מולקולריות
A-21468	בשימוש בדילול של 1:500
Name	Company	Catalog Number	Comments	Microscopes				מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי הפוך Axiovert 200	Zeiss		להדמיה של ה-FT
AxioImager.Z1 מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי זקוף עם Apotome	Zeiss		להדמיה של FT מוכתם חיסוני שלם

שלמה סופי סופי סופי של 1:500 של 1:500