צביעה חיסונית של נוירונים בפרוסות מוח של עכבר בעקבות הכלאה פלואורסצנטית באתרה

תקציר

מקור: Baleriola, J., et. al., זיהוי mRNAs מקומיים אקסונליים בחלקי מוח באמצעות הכלאה ברזולוציה גבוהה באתר. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מדגים את זיהוי ה-mRNA בתוך אקסונים כולינרגיים בפרוסות היפוקמפוס קבועות של עכבר באמצעות הכלאה פלואורסצנטית באתרה וצביעת נוגדנים. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית חושפת את הלוקליזציה המרחבית של mRNAs מתויגים בבדיקה וכולין אצטילטרנספראז בנוירונים כולינרגיים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המתאימה לבעלי חיים.

1. בדיקת FISH ואחריה אימונוהיסטוכימיה באמצעות חשיפת אנטיגן/RNA המושרה על ידי חום
   1. לפני שמתחילים, הכינו את כל החומר הנדרש:
      1. מחממים את תנור ההכלאה ל-40 מעלות צלזיוס ומניחים מגש המכיל מים מזוקקים בתנור ליצירת סביבה לחה.
      2. קח קופסת שקופיות והניח בתוכה מגבות נייר ספוגות במים מזוקקים כדי להרטיב אותה. לאחר מכן, הכניסו את קופסת השקופיות לתנור ההיברידיזציה.
      3. מוציאים את הבדיקות (הן שליליות והן בדיקות מטרה) מהמקרר ומחממים אותם בתנור ההכלאה למשך 10 דקות. לאחר מכן, תן לבדיקות להתקרר ב-RT.
      4. ריאגנטים להגברת שיווי משקל AMP 1-4 (כלול בערכת ריאגנט מולטיפלקס פלואורסצנטי) ב-RT.
      5. הכן תמיסת אחזור אנטיגן: 10 מ"מ נתרן ציטראט (pH 6), 0.05% טווין 20. הערה: ניתן לאחסן את התמיסה ב-RT ללא הגבלת זמן ולהשתמש בה לצביעה עתידית.
      6. הכן מאגר כביסה 1x המדלל את תמיסת המלאי פי 50 (בערכת ריאגנט מולטיפלקס פלואורסצנטי) במים נטולי RNase או שטופלו ב-DEPC.
         הערה: ניתן לאחסן מאגר כביסה 1x ב-RT למשך חודש אחד ולהשתמש בו לצביעה עתידית. מאגר כביסה פי 50 עלול לזרז. אם כן, יש לחמם את מאגר הכביסה פי 50 בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפני הכנת תמיסת ה-1x.
   2. הסר שקופיות מ-100% אתנול וייבש באוויר למשך 5 דקות ב-RT.
   3. הכן צנצנת קופלין המכילה 50 מ"ל של תמיסת אחזור אנטיגן. טבלו שקופיות בתמיסת אחזור אנטיגן והרתיחו אותן במשך 10 דקות במיקרוגל.
      הערה: לחלופין הנח שקופיות אופקית בכלי זכוכית עגול בקוטר 100 מ"מ המכיל 100 מ"ל של תמיסת שליפה.
      1. ממלאים כוס של 1 ליטר במים מזוקקים ומכניסים למיקרוגל.
         הערה: המים "יחצצו" את החום בעת ביצוע הסרת המסכה.
      2. הנח את השקופיות בתמיסת אחזור אנטיגן בתוך המיקרוגל. מרתיחים מגלשות בעוצמה גבוהה למשך 5 דקות. מיד לאחר שהדגימות הפסיקו לרתוח, מחממים שוב את המגלשות בעוצמה גבוהה למשך 5 דקות נוספות.
      3. יש לקרר את השקופיות ב-RT.
         הערה: שלב קריטי: משך הרתיחה והליך הרתיחה צריכים להיקבע על ידי המשתמש, בהתאם למאפייני המיקרוגל. ככל שהרתיחה מתחילה מהר יותר, כך גדלים הסיכויים לאידוי התמיסה. במקרה זה מומלץ להרתיח דגימות לפרקי זמן קצרים יותר מפעמיים כדי להשלים זמן חשיפה כולל של 10 דקות. נהפוך הוא, אם החימום מתבצע בעוצמה בינונית או נמוכה, ניתן לבצע הסרת מסכה פעם אחת למשך 10 דקות. עם זאת, אם הדגימות אינן רותחות ברציפות במשך כ-10 דקות בסך הכל, הדבר עלול לגרום לחשיפה חלקית של RNA המטרה והחלבון שיש לזהות.
   4. שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם 1x PBS.
   5. הוסף 2 - 3 טיפות (~100 מיקרוליטר) של ערכת הבדיקה dapB לפרוסות המוח המשמשות להערכת צביעת רקע. הערה: ערכת הבדיקה dapB מכוונת לגן חיידקי ולא אמורה לזהות שום RNA של יונקים.
   6. הוסף 2 - 3 טיפות של ערכת בדיקת המיקוד לאותן פרוסות מוח המשמשות לזיהוי ה-RNA המעניין. הערה: ערכת בדיקה המכוונת לשאריות 20 - 1,381 של העכבר Atf4 mRNA משמשת בדוגמה זו.
   7. מכסים את השקופיות בפרפילם כדי למנוע אידוי בדיקה, מניחים אותם בקופסת השקופיות הלחה בתוך תנור ההכלאה, ומדגרים אותם בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
      הערה: אופציונלי: ניתן להכליא פרוסות מוח נוספות עם ערכת בדיקה המכוונת לעכבר Polr2A ולהשתמש בהן כבקרות חיוביות.
   8. שטפו את השקופיות פעמיים עם מאגר כביסה אחד למשך 2 דקות ב-RT.
   9. הוסיפו 2-3 טיפות של מגיב הגברה AMP 1-FL לכל פרוסת מוח, כסו את השקופיות בפרפילם, הניחו אותן בתיבת השקופיות, ודגרו בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בתנור ההכלאה.
   10. שטפו את השקופיות פעמיים עם מאגר כביסה אחד למשך 2 דקות ב-RT.
   11. הוסיפו 2-3 טיפות של מגיב הגברה AMP 2-FL לכל פרוסת מוח, כסו את השקופיות בפרפילם, הניחו אותן בתיבת השקופיות ודגרו בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בתנור ההכלאה.
   12. שטפו את השקופיות פעמיים עם מאגר כביסה אחד למשך 2 דקות ב-RT.
   13. הוסיפו 2-3 טיפות של מגיב הגברה AMP 3-FL לכל פרוסת מוח, כסו את השקופיות בפרפילם, הניחו אותן בתיבת השקופיות ודגרו בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בתנור ההכלאה.
   14. שטפו את השקופיות פעמיים עם מאגר כביסה אחד למשך 2 דקות ב-RT.
   15. הוסיפו 2-3 טיפות של מגיב הגברה AMP 4-FL לכל פרוסת מוח, כסו את השקופיות בפרפילם, הניחו אותן בקופסת השקופיות ודגרו בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בתנור ההכלאה.
   16. שטפו את המגלשות פעמיים עם מאגר כביסה אחד למשך 2 דקות ב-RT ופעמיים עם 1x PBS.
   17. הוסף לשקופיות 100 - 200 מיקרוליטר (או נפח מספיק כדי לכסות לחלוטין פרוסות) של תמיסת חסימה המכילה 3 מ"ג/מ"ל BSA, 100 מ"מ גליצין ו-0.25% טריטון X-100 ב-PBS (pH 7.4) לשקופיות, כסה אותן בפרפילם, ודגירה למשך 30 דקות ב-RT.
   18. הוסף 100 - 200 מיקרוליטר של נוגדן נגד ChAT מדולל בתמיסה חוסמת (1/100) לשקופיות, מכסים אותם בפרפילם, ודוגרים במשך יומיים בחום של 4 מעלות צלזיוס. וודאו שפרוסות המוח לא יתייבשו. במידת הצורך, יש למרוח מחדש את תמיסת הנוגדנים נגד ChAT על פרוסות מוח 24 שעות לאחר הדגירה.
   19. שטפו את השקופיות שלוש פעמים ב-1x PBS למשך 5 דקות ב-RT.
   20. הוסיפו 100 - 200 מיקרוליטר של הנוגדן המשני המצומד המתאים של אלקסה ( למשל., Alexa-594 donkey anti-goat לדוגמא הספציפית הזו) לשקופיות, כסו בפרפילם, ודגרו למשך שעה אחת ב-RT.
   21. }שטפו את השקופיות שלוש פעמים ב-1x PBS למשך 5 דקות ב RT.
   22. שטוף שקופיות פעם אחת במים מזוקקים.
   23. הרכיב שקופיות עם מדיום הרכבה המכיל DAPI.
   24. דמיינו פרוסות מוח תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
בדיקה מותאמת אישית המכוונת לשאריות 20-1381 של העכבר Atf4 mRNA (NM_009716)	Advanced Cell Diagnostics	-	בדיקה
בדיקה מותאמת אישית המכוונת לשאריות 15-1256 של ה-mRNA האנושי ATF4 (NM_001675.2)	Advanced Cell Diagnostics	-	בדיקה
בדיקת בקרה שלילית-DapB	Advanced Cell Diagnostics	310043	בדיקה
עכבר בדיקה חיובי Polr2A (אופציונלי)	Advanced Cell Diagnostics	312471	בדיקה
goat polyclonal anti-ChAT anti-ChAT anti-HAT	Millipore	AB144P
ProLong זהב הרכבה עם DAPI	Life Technologies	P36935
RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (לזיהוי פלואורסצנטי)<	320850	ערכת הכלאה באתרה

td style='width:139pt;'>Advanced Cell Diagnostics