הדמיה ברזולוציה גבוהה של קולטנים נוירוטרנסמיטורים בסינפסות רשתית

תקציר

מקור: Zhang, J., et al. ניתוח אימונוגולד כמותי ברזולוציה גבוהה של קולטני ממברנה בסינפסות סרט הרשתית. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים טכניקת מיקרוסקופ אלקטרונים להמחשת לוקליזציה של קולטני נוירוטרנסמיטורים בסינפסות רשתית. חלקי הרשתית מכילים תאי גנגליון ברשתית המציגים קולטנים נוירוטרנסמיטורים הקשורים לממברנה ומסומנים בתת-יחידה B של רעלן כולרה (CTB). עם תיוג הסמנים בנוגדנים מצומדים לננו-חלקיקי זהב וצביעה נגדית של הקטע במתכות כבדות, קולטני ה-RGC מוצגים במיקרוסקופ.

פרוטוקול

כל ההליכים הקשורים לדגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לביקורת אתית של בעלי חיים.

1. קיבוע רקמת רשתית

1. הרכיבו את החומרים והכלים הבאים: מיקרוסקופ מנתח, 2 מלקחיים עם קצוות עדינים מאוד, מספריים, נייר סינון תאית, פיפטה מפלסטיק ושקופית מיקרוסקופ.
2. להרדים את החולדה בתא סגור עם 2.0 מ"ל הלותן (חומר הרדמה נדיף). קבע הרדמה נאותה בשיטות אלה: חוסר נסיגה של כף הרגל האחורית לאחר צביטת הבוהן, או היעדר רפלקס מצמוץ. ואז לערוף את הראש מיד עם גיליוטינה. הסר את העיניים בעזרת מספריים לקשתית והניח בכלי זכוכית המכיל 4% פרפורמלדהיד במאגר פוספט 0.1 M (PB) ב-pH 7.4.
3. בעזרת מיקרוסקופ הניתוח, הסר את הקרנית על ידי חיתוך החלק הקדמי של גלגל העין. הסר את העדשה והזגוגית ממשטח הרשתית הפנימי בעזרת מלקחיים.
4. קלף את הסקלרה עם שני המלקחיים עד לבידוד הרשתית מכוס העין.
5. חותכים את הרשתית מיד לרצועות בעובי 100 - 200 מיקרומטר בעזרת סכין גילוח, ונתונים לקיבוע משמרת pH.
6. תקן רצועות רשתית ב-4% פרפורמלדהיד ב-0.1 M PB ב-pH 6.0 למשך 20 - 30 דקות ולאחר מכן ב-4% פרפורמלדהיד בתוספת 0.01% גלוטראלדהיד ב-pH 10.5 למשך 10 - 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
7. לאחר מספר שטיפות ב-PB עם 0.15 מ"מ CaCl₂ (pH 7.4 ב-4 מעלות צלזיוס), הגן בהקפאה על רצועות הרשתית עם גליצרול (60 דקות כל אחת ב-10%, 20%, 30%, ולאחר מכן לילה [O/N] ב-30%) ב-0.1 M PB לפני החלפת ההקפאה.

2. הקפאה-החלפה

הערה: שיטת הקפאה-החלפה זו שונה מפרוטוקול שפורסם קודם לכן. כמו כן, חיוני שהמכשירים יהיו קרים מאוד (ללבוש כפפות); אחרת, הרקמה עלולה להפשיר חלקית כאשר נוגעים בה במכשירים. כל השלבים הללו נעשים בתוך תא ההקפאה האוטומטי (AFS) והמכשירים לעולם אינם מורשים לנוע מעל שפת החדר. באופן דומה, יש צורך בקירור נכון של כל הכימיקלים המשמשים ב-AFS.

1. צלילה-הקפאה של רצועות הרשתית בפרופאן נוזלי בטמפרטורה של -184 מעלות צלזיוס במכשיר לשימור הקפאה (CPC) במיקרוסקופ אלקטרונים (EM). בעזרת מברשת עדינה, הניחו את הדגימות על חתיכות קטנות של סרט דבק כפול המחוברות לדפי המתכת ההולכים על קצה מוטות הצלילה (נדפו חיץ נוסף באמצעות המברשת).
2. צללו את המוטות לתוך הפרופאן הנוזלי ושמרו אותם שם למשך כ-5 שניות, ולאחר מכן העבירו למכשיר החלפת ההקפאה האוטומטי (AFS) באמצעות תא הובלה קטן הממולא בחנקן נוזלי (LN₂ מיכל העברת קריו מקורר).
3. לאחר הנחת הדגימה והמכשירים הקפואים (מלקחיים ואזמל) לתוך ה-AFS, יש לקרר את המכשירים בתא למשך מספר דקות לפני שנוגעים ברקמה, או לקרר אותם על ידי הנחת קצות המכשירים למשך מספר שניות לתוך תא ההובלה הקטן (מלא בחנקן נוזלי (LN₂ מיכל העברת קריו מקורר)).
4. ברגע שנכנסים ל-AFS, הסר את הדגימה והסרט מהבדל בעזרת אזמל דק. כמו כן, שמור על בקרת זרימת גז החנקן, TF (TF מתואר כ'בקרת רגולטור עבור LN₂') פתוחה במהלך הליכים אלה.
5. לפני הנחת הרקמה הקפואה במחזיקי ההטבעה השטוחה (כלומר., לפני הגדרת ה-AFS), חותכים עיגול דק מגיליון פלסטיק שקוף ומניחים אותו בתחתית המחזיק כדי לרפד את החלק התחתון של כל באר. זה מאפשר הסרה קלה יחסית של גושי הדגימה הפולימרים בסיום.
   הערה: בעבר השתמשנו בשיטה חלופית למחזיקי ההטבעה השטוחים, והשתמשנו בכמוסות רייכרט + ג'לטין כפולות.
6. השתמש ברצף האוטומטי הבא ב-AFS (תוך שימוש בטרמינולוגיה של מכשירים): T1 = -90°C למשך 32 שעות, S1 = העלאת טמפרטורה ב-4°C/hr (11.3 שעות), T2 = -45°C למשך 50 שעות, S2 = העלאת טמפרטורה ב-5°C/שעה (9 שעות), T3 = 0°C למשך 40 שעות (סה"כ = 142.3 שעות). ייתכן שיידרשו 2 - 4 שעות למקם דגימות ב-AFS (ב-90 מעלות צלזיוס) לפני תחילת הרצף המתוזמן.
7. טבלו את החלקים הקפואים ב-1.5% אורניל אצטט במתנול בטמפרטורה של -90 מעלות צלזיוס למשך >32 שעות ב-AFS. הנח שתי חתיכות רקמות (בדרך כלל) בכל אחת משבע הבארות במחזיק האלומיניום השטוח (שלוש מתאימות ל-AFS).
   1. הנח את הרקמה + הסרט לתוך האורניל אצטט/מתנול בבארות והסר את הסרט מאוחר יותר, ממש לפני תחילת החדרת מדיום ההטמעה (כגון Lowicryl HM20), אם קשה מדי להסיר את הרקמה מהסרט.
8. לאחר מכן הגדל את הטמפרטורה בשלבים ל-45 מעלות צלזיוס (+4 מעלות צלזיוס לשעה; ברצף האוטומטי).
9. שטפו את הדגימות שלוש פעמים במתנול מקורר מראש, על ידי שימוש בפיפטה מפלסטיק עדינה כדי להסיר את התמיסה הישנה מכל מחזיק הטבעה שטוחה, ולאחר מכן השתמשו בפיפטה פלסטיק סטנדרטית אחרת כדי להוסיף את המתנול הטרי שהתקרר מראש.
10. לאחר מכן, באותה שיטה, הסתננו לדגימות בהדרגה עם שרפי הטמעה בטמפרטורה נמוכה כגון מדיום הטבעה (HM20/מתנול ב-1:1 ו-2:1, כל אחד למשך שעתיים, ואחריו שרף טהור למשך שעתיים ולאחר מכן החלף את השרפים ושמור על O/N).
11. החלף את השרף שוב למחרת, והתאם את רמת השרף כך שתגיע רק לקצה העליון של הבארות.
12. פילמרו את הדגימות (-45 מעלות צלזיוס עד 0 מעלות צלזיוס ברצף אוטומטי; +5 מעלות צלזיוס לשעה) באור אולטרה סגול (UV) למשך 40 שעות.
13. ואז הסר את הדגימות מה-AFS. בדרך כלל, בלוקים לדוגמה עדיין מראים מעט ורוד בצבע. הנח את הדגימות קרוב לאור הפלואורסצנטי במכסה האדים הכימי, ב-RT O/N או יותר עד שהן נראות צלולות לחלוטין.

3. לאחר הטמעת אימונוציטוכימיה של EM Immunogold

1. חותכים קטעים של 1 מיקרומטר עם אולטרה-מיקרוטום, צובעים קטעים עם 1% טולואידין-כחול, ובודקים אותם לכיוון החתך; כוון את גוש הרקמה כדי להשיג את מישור החיתוך הרוחבי האופטימלי.
2. חותכים חלקים דקים במיוחד בעובי 70 ננומטר עם אולטרה-מיקרוטום ואוספים אותם על רשתות חריצי ניקל מצופות פחמן Formvar.
3. שטפו את הרשתות פעם אחת בשטיפה מזוקקת H₂O ואחריה תמיסת מלח עם טריס שלוש פעמים (TBS, 0.05 M Tris buffer, 0.7% NaCl, pH 7.6).
4. דגרו רשתות ב-20 מיקרוליטר טיפות של 5% אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-TBS למשך 30 דקות, ולאחר מכן בטיפות של 20 מיקרוליטר של תערובת המכילה תת-יחידה B של רעלן נגד כולרה עיזים (anti-CTB, 1:3,000) ונוגדנים לתת-יחידה אחת של קולטן N-methyl-D-aspartate (NMDAR) (תת-יחידה NMDAR גלוטמטרגית נגד ארנב A [GluN2A] 1:50, GluN2B 1:30), או GluA2/3 נגד ארנב (קולטן הטרוטרמטי α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid [AMPA], 1:30) ב-TBS-Triton (TBST, 0.01% Triton X-100, pH 7.6) עם 2% BSA ו-0.02 M NaN₃ O/N ב-RT.
5. שטפו את הרשתות על שלוש טיפות נפרדות (20 מיקרוליטר) של TBS (pH 7.6) למשך 10, 10 ו-20 דקות, ולאחר מכן TBS (pH 8.2) למשך 5 דקות.
6. דגרו רשתות למשך שעתיים טיפות (20 מיקרוליטר) של תערובת המכילה אימונוגלובולין G נגד ארנב של חמור (IgG, 1:20) יחד עם חלקיקי זהב של 10 ננומטר ו-IgG נגד עזים של חמורים (1:20) יחד עם חלקיקי זהב של 18 ננומטר ב-TBST (pH 8.2) עם 2% BSA ו-0.02 מיליון NaN₃.
7. שטפו את הרשתות בטיפות של 20 מיקרוליטר TBS (pH 7.6) למשך 5, 5 ו-10 דקות, ואז במים טהורים במיוחד ולאחר מכן יבשו אותן.
8. רשתות נגד כתמים עם 5% אורניל אצטט ו-0.3% ציטראט עופרת ב-H₂O מזוקק למשך 8 ו-5 דקות בתנאי חושך, בהתאמה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Paraformaldehyde	EMS	15710
Glutarldehyde	EMS	16019
NaH2PO4	Sigma	S9638
Na2HPO4	Sigma	7782-85-6
CaCl2	Sigma	C-8106
BSA	Sigma	A-7030
Triton X-100	Sigma	T-8787
NaOH	Sigma	221465
NaN3	JT Baker	V015-05
Glycerol	Gibco BRL	15514-011
Lowicryl HM 20	Polysciences	15924-1
Tris-Base	Fisher	BP151-500
Tris	Fisher	04997-100
Anti-GluN2A	Millipore	AB1555P	דילול 1/50
Anti-GluN2B	Millipore	AB1557P	דילול 1/30
Anti-GluA2/3	Millipore	AB1506	דילול 1/30
אנטי-PSD-95	Millipore	MA1–046	דילול 1/100
חמור נגד ארנב IgG-10 ננומטר חלקיקי זהב	EMS	25704	דילול 1/20
חמור נגד עכבר IgG-10 ננומטר חלקיקי זהב	EMS	25814	דילול 1/20
חמור נגד עכבר IgG-5 ננומטר חלקיקי זהב	EMS	25812	דילול 1/20
חמור נגד עזים IgG-18 ננומטר חלקיקי זהב	Jackson ImmunoResearch	705-215-147	דילול 1/20
רשתות חריצי ניקל מצופות Formvar-Carbon.	EMS	FCF2010-Ni
Uranyl acetate	EMS	22400-1
מתנול	EMS	67-56-1
ציטראט עופרת	Leica
Leica EM AFS	Leica
Leica EM CPC	Leica
Ultromicrotome	Leica
JEOL 1200 EM	JEOL
חנקן	נוזלי רוברטס חמצן
פרופאן	רוברטס חמצן
רשימת CTB	מעבדות ביולוגיות	104	1-1.2%
רשימת אנטי-CTB	מעבדות ביולוגיות	703	דילול 1/4000