ניטור בזמן אמת של הפעלת קולטני ריח בתאים רקומביננטיים

תקציר

מקור: de March, C. A. et. al., ניטור בזמן אמת במבחנה של הפעלת קולטני ריח על ידי ריח בשלב האדים. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים את השיטה לניטור הפעלה בזמן אמת של קולטני ריח בתאי יונקים רקומביננטיים באמצעות מדידת לומינסנציה. קשירת ריח מפעילה הפעלת חלבון G וייצור cAMP, ומפעילה חלבוני גלו-סנסור הפולטים זוהר בעת קשירת המצע, ומספקים מדד כמותי לתגובת הקולטן.

פרוטוקול

1. Hana3A Cells Culture

1. Prepare M10 (Minimum Essential Medium (MEM) בתוספת 10% v/v סרום בקר עוברי (FBS)) ו-M10PSF (M10 בתוספת 100 מיקרוגרם/מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין ו-1.25 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B).
2. תרבית התאים ב-10 מ"ל של M10PSF בצלחת תרבית תאים של 100 מ"מ באינקובטור המוגדר ל-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני (CO2).
3. חלקו את התאים כל יומיים ביחס של 20%: כאשר נצפה מפגש של 100% של תאים (כ-1.1 x 10⁷ תאים) תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה, שאפו את המדיה ושטפו את התאים בעדינות עם 10 מ"ל של מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS).
4. שאפו PBS והוסיפו 3 מ"ל של 0.05% חומצה טטראצטית טריפסין-אתילן דיאמין (EDTA, 0.48 מ"מ). מניחים לפעול כדקה, עד שהתאים מתנתקים מהצלחת.
5. הוסף 5 מ"ל של M10 כדי לנטרל את הטריפסין ובסופו של דבר לנתק את התאים שעדיין מחוברים לצלחת על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
6. העבירו את הנפח (8 מ"ל) לצינור של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב-200 x g למשך 5 דקות. שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ל-5 מ"ל של M10PSF על ידי פיפטינג למעלה ולמטה כדי לשבור כל מסת תא. הימנע מיצירת בועות בצינור.
7. העבירו 1 מ"ל מתמיסת התאים המרחפים בצלחת תרבית תאים חדשה של 100 מ"מ והוסיפו 9 מ"ל של M10PSF טרי. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂.

2. הכנת התאים לטרנספקציה

1. הערך את המפגש, או את מספר התאים, על ידי התבוננות בהם תחת מיקרוסקופ ניגוד פאזה. יש צורך לפחות 10% מפגש (כ -1.1 x 10⁶ תאים) לצלחת אחת.
2. שאפו את המדיה ושטפו את התאים בעדינות עם 10 מ"ל PBS. שאפו PBS והוסיפו 3 מ"ל של EDTA. מניחים לפעול כדקה בטמפרטורת החדר, עד שהתאים מתנתקים מהצלחת.
3. הוסף 5 מ"ל של M10 כדי לנטרל את הטריפסין ובסופו של דבר לנתק את התאים שעדיין מחוברים לצלחת על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. העבירו את הנפח (8 מ"ל) לצינור של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב -200 x גרם למשך 5 דקות.
4. שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ל-5 מ"ל של M10PSF על ידי פיפטינג למעלה ולמטה כדי לשבור כל מסת תא. הימנע מיצירת בועות בצינור.
5. בהתאם למספר הלוחות שיש להעביר, העבר כמות מתאימה של תאים במאגר עם הנפח המתאים של M10PSF. יש לצפות צלחת אחת של 96 בארות ב-1/10 של צלחת 100% 100 מ"מ (כ-1.1 x 10⁶ תאים) מדוללת ב-M10PSF כדי להגיע לנפח כולל של 6 מ"ל. עבור צלחת אחת של 96 בארות המתחילה בצלחת 100% מפגש של 100 מ"מ, הוסף 500 מיקרוליטר מ-5 מ"ל של תאים תלויים ל-5.5 מ"ל של M10PSF טרי. מערבבים את התאים ו- M10PSF מבלי ליצור בועות אוויר.
6. פיפטה 50 מיקרוליטר של התאים התלויים לכל באר של צלחת 96 הבארות באמצעות פיפטה רב-ערוצית. דגירה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5%_CO2.

3. Plasmid Transfection

1. התבונן בלוח 96 הבארות תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה כדי להבטיח מפגש תאים בין 30% ל-50%.
2. הכן תערובת טרנספקציה ראשונה המכילה את הפלסמידים המשותפים לכל הצלחת (גרסה קצרה יותר של חלבון מעביר קולטן 1 (RTP1S), קולטן ריח (OR) וחלבון Glosensor; ראה טבלת חומרים) בעקבות הנפחים בטבלה 1. שים לב שיש לחלק את כמות ה-OR המתויג במספר ה-OR אם מספר OR.
   הערה: אנו ממליצים בחום להוסיף בקרה שלילית וקטורית ריקה (כאן Rho-pCI) וכל בקרה חיובית (OR ידוע כמגיבה לריח שנבדק) לתוכנית הניסוי.
3. הכינו תערובת טרנספקציה שנייה המכילה 500 מיקרוליטר של MEM ו-20 מיקרוליטר של מגיב ליפופקטמין 2000 (תקף לצלחת אחת של 96 בארות, ראה טבלת חומרים). מוסיפים את התערובת השנייה לראשונה, ומערבבים בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה ודוגרים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. מוסיפים 5 מ"ל M10 ומערבבים בעדינות.
4. החלף את ה-M10PSF בלוח 96 הבארות המצופה קודם לכן ב-50 מיקרוליטר של מדיית הטרנספקציה הסופית. דגירה בחממה המוגדרת ל-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ ושואב את תא הלומינומטר למשך הלילה.

4. Substrate Incubation

1. התבונן בלוח 96 הבארות תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה כדי להבטיח מפגש תאים בין 60% ל-100%. הכן תמיסת סימולציה של תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) המכילה 10 מ"מ של חומצה הידרוקסיאתיל פיפרזינאתנסולפונית (HEPES) ו-5 מ"מ של D-גלוקוז.
2. לדלל 75 מיקרוליטר של תמיסת המגיב המחזורי אדנוזין מונופוספט (cAMP) (ראה טבלת חומרים) ל-2.75 מ"ל של תמיסת הגירוי. הסר את מדיום הטרנספקציה מצלחת 96 הבארות ושטוף את התאים על ידי הוספת 50 מיקרוליטר של תמיסת גירוי טרייה לכל באר.
3. הסר את תמיסת הגירוי והוסף 25 מיקרוליטר של תמיסת ריאגנט cAMP שהוכנה בשלב 4.2 לכל באר. דגרו את צלחת 96 הבארות בטמפרטורת החדר בסביבה חשוכה ונטולת ריחות (למשלample, מגירה ריקה ונקייה הרחק מכימיקלים או כל מקור ריח) למשך שעתיים.

5. Odorant Stimulation

1. ראשית, יש לאזן את תא הלומינומטר עם מולקולות ריח נדיפות. לדלל את הריח לריכוז הרצוי ב-10 מ"ל שמן מינרלי (איור 1A). לפני תום זמן הדגירה של מגיב cAMP, הוסף 25 מיקרוליטר מתמיסת הריח לצלחת חדשה של 96 בארות (לא זו המכילה את התאים). דגרו על צלחת ריח זו בטמפרטורת החדר בתא הלומינומטר למשך 5 דקות (איור 1B) (אין צורך ברישום לומינומטר כאן).
2. הגדר את הלומינומטר כך שיתעד את הזוהר עם עיכוב של 0 שניות במהלך 20 מחזורים של מדידת צלחת של 90 שניות עם מרווח של 0.7 שניות בין מחזורים.
3. ממש לפני קריאת הצלחת, הסר את לוחית הריח מהתא. הוסיפו 25 מיקרוליטר של ריח בין הבארות של צלחת 96 הבארות שמכילה את התאים (אל תוסיפו את הריח בבארות שמכילות את התאים) והתחילו במהירות את מדידת הזוהר של כל הבארות במשך 20 מחזורים בתוך 30 דקות (איור 1C).

Table 1: Mix for transfection. כמויות של פלסמידים (חלבון Glosensor, RTP1S ו-OR) להוסיף ל-MEM כדי להעביר לצלחת אחת של 96 בארות.

	לכל צלחת 96 באר
MEM	500 μL
pGlosensor	10 ng
RTP1S	5 ng
OR	75 ng

 

תוצאות

איור 1: פרוטוקולים סכמטיים לניטור בזמן אמת של הפעלת קולטני ריח על ידי ריח מאודה. הריח (סגול) דולל בריכוז הרצוי בשמן מינרלי (A). לאחר מכן התמיסה צופה לתוך צלחת חדשה של 96 בארות, שה...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.05 % trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	0.05% Trypsin - EDTA (1x), פנול אדום - אחסן ב-4 °C
100 מ"מ צלחת תרבית תאים	BD Falcon	353003	100 מ"מ x 20 מ"מ צלחת
15 מ"ל tube	BD Falcon	352099	17 מ"מ x 120 מ"מ צינורות חרוטיים
96-well plate	Corning	3843	96 well, עם מכסה LE לבן עם תחתית שקופה מצופה פולי-D-lysine Polystyrene
Amphotericin	Gibco	15290-018	Amphotericin B 250 μg/mL - יש לאחסן ב-4 °C
מכונת צנטריפוגה	Jouan	C312	מכונת צנטריפוגה עם רוטור דלי מתנדנד ל-15 מ"ל
Class II סוג A/B3 fumehood	NUAIRE	NU-407-500	vaporhood for cell culturing
FBS	Gibco	16000-044	סרום בקר עוברי - אחסן ב-20 °C
GloSensor cAMP Reagent	Promega	E1290	GloSensor cAMP Reagent מצע חלבון זוהר - יש לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס
Incubator 37°C; 5% פחמן דו-חמצני	Fisher Scientific	11-676-604	Incubator for Cell culturation
Lipofectamine 2000 reagent	Invitrogen	11668-019	Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection Reagent - אחסן ב-4 ° C
Luminometer POLARstar OPTIMA	BMG LABTECH	discontinued	96 באר קורא צלחות לזוהר
שמן מינרלי	Sigma	M8410	ממס לריח - יש לאחסן בטמפרטורת החדר
Minimum Essential Medium (MEM)	Corning cellgro	10-010-CV	Minimum Essential Medium Eagle with Earle's Salts & L-glutamine - יש לאחסן ב-4 מעלות צלזיוס
Penicillin/Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333	תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין מיוצבת עם 10,000 יחידות של פניצילין ו-10 מ"ג סטרפטומיצין - יש לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס
pGlosensor	Promega	E2301	pGloSensor-22F cAMP פלסמיד חלבון זוהר - אחסן ב-4 °C
Phase contrast microscope	Leica	090-131.001	מיקרוסקופ ניגודיות פאזה עם x4, x10, x20 מטרות
RTP1S	H. Matsunami lab	-	100 ng/μL פלסמיד - יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס

תרבית תאים