$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.
1. הרדמה להכנה לקליפת המוח
- הנח את העכבר בתא אינדוקציה עם 2-3% איזופלואורן מעורבב עם חמצן כדי לגרום להרדמה. שימו לב לירידה בקצב הנשימה כאשר העכבר מושרה . צבטו את כף העכבר כדי לקבוע אם העכבר מוכן לעבור לקונוס האף. הערה: רמת ההרדמה היא שלב קריטי בכל הכנה של in vivo ויש לנקוט בזהירות שלא לגרום לרמה שתגרום לאיסכמיה גלובלית.
- לאחר שהעכבר מורדם מספיק, העבירו את החיה לפלטפורמת הניתוח/הדמיה והניחו את אף העכבר בקונוס האף ומרחו 1-1.2% איזופלואורן כדי לשמור על מצב הרדמה. ודא שהעכבר שוכב על כרית חימום מבוקרת טמפרטורה כדי לשמור על טמפרטורת הגוף (37°C +/- 0.5°C) לאורך כל ההליכים הנותרים. יש להניח משחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע יובש בזמן ההרדמה.
- עקוב אחר הפיזיולוגיה של העכבר באמצעות מערכת אוקסימטריית דופק באמצעות קליפ הזנב או כף הרגל המצורף למערכת. בדוק שקצב הנשימה נשמר בין 50-65 נשימות לדקה. בדוק שקצב הלב נשאר בין 300 ל-450 פעימות לדקה וריווי החמצן נשמר בין 97-98% כדי להבטיח הישרדות ארוכת טווח של בעל החיים.
- כאשר העכבר מורדם כראוי, יש לגלח את השיער מעל הגולגולת באמצעות קוצץ חשמלי, להסיר שאריות שיער ולנקות עם בטאדין, ולאחר מכן ספוגית אתנול. חזור על הליך זה עד שלוש פעמים כדי להבטיח סביבה כירורגית סטרילית.
2. הליך כירורגי
- כשהקרקפת נקייה ומגולחת לחלוטין, בצע חתך של 5 מ"מ בקרקפת העכבר כדי לחשוף את סדקי הגולגולת ולאתר ברגמה.
- השתמש באפליקטור כותנה סטרילי כדי להסיר את כל הפאשיה שנותרה מעל הגולגולת.
- הדביקו טבעת נירוסטה בהתאמה אישית (איור 1) עם דבק רקמות לעצם המכסה את קליפת המוח הקודקודית באמצעות הקואורדינטות הסטריאוטקסיות של ברגמה: -1 עד -3 מ"מ ולרוחב: 2-4 מ"מ. הערה: הדבק מתייצב בדרך כלל תוך 2 דקות לאחר הנחת הטבעת על העצם.
- הצמד את הטבעת למחזיק סטריאוטקסי ( איור 2) כדי לייצב את העכבר ולמנוע תנועה במהלך ההדמיה.
- תחת מיקרוסקופ ניתוח בדרגה כירורגית, קדחו לאט חתך של 1-2 מ"מ בגולגולת באמצעות כלי דמוי דרמל מבוקר מהירות (מקדח מייסינגר 3.9 מ"מ) והקפידו לשמור על השטח ישר בזמן הקידוח. השיגו זאת באמצעות דפוס זיג-זג. כדי למנוע הצטברות חום, הגדר את מהירות המקדחה לנמוכה וצא להפסקות תכופות.
- כאשר הגולגולת הופכת למבריקה במראה, המשך בדילול הגולגולת באמצעות להב אזמל המשתמש באותה תבנית זיג-זג כדי לשמור על פני השטח הדקים כדי להקל על הסרה חלקה של שכבות דקות של גולגולת גולגולת. בעזרת קצה להב האזמל בצע משיכות ליניאריות קטנות בלחץ קל כדי להסיר שכבות דקות של עצם בכל פעם. המשך עד שכלי הדם נראים בבירור דרך המיקרוסקופ המנתח.
- אם הנסיין מנקב או שובר את הגולגולת במהלך תהליך הדילול, המתת חסד של החיה עקב נזק סביר לקליפת המוח הבסיסית.
הערה: עובי גולגולת העכבר הוא כ-300 מיקרומטר והיא מורכבת משתי שכבות דקות של עצם קומפקטית (אחת חיצונית ואחת פנימית) ושכבה של עצם ספוגית דחוקה בין שתי שכבות העצם הקומפקטית. השכבה החיצונית של העצם הקומפקטית ורוב העצם הספוגית מוסרות בתוך אזור הקידוח של 5 מ"מ, וכתוצאה מכך נותרה שכבה של כ-50 מיקרומטר של עצם קומפקטית (ראו איור 2B). הדמיה של כלי הדם תבטיח שהגולגולת הדלילה השלמה הסופית תהיה בעובי של כ-50 מיקרומטר. לכן הגולגולת עדיין קיימת כאשר מדללים אותה לעובי זה.
3. הגדרת מיקרוסקופ
- השתמש במערכת מיקרוסקופ הפוכה (מערכות קונבנציונליות, קונפוקליות או דו-פוטוניות) שיש לה מהפך אובייקטיבי. הערה: אפשר גם להשתמש במיקרוסקופ זקוף סטנדרטי. הגורם המגביל יהיה המרווח בין הבמה לבין המטרות. ייתכן שיהיה צורך בשינויים ב-stage כדי לבצע הגדרה זו.
- אבטח את פלטפורמת הניתוח / הדמיה לשלב מותאם אישית הממוקם בצד בסיס המיקרוסקופ. הערה: הפלטפורמה מיוצרת באמצעות שקע מעבדה כדי לאפשר תנועה אנכית של פלטפורמת הניתוח/הדמיה מתחת למטרה. שקע המעבדה מותקן על צלחת המודבקת לארבעה מוטות גליליים. (ראה איור 2).
- מקם את מהפך המטרה המכיל מטרה פי 20 מעל חלון הגולגולת. השתמש במקור אור חיצוני כדי למצוא את חלון הגולגולת על ידי התבוננות דרך עיניות המיקרוסקופ ומקם את המטרה באזור ההדמיה. הערה: אזור ההדמיה יסומן על ידי נוכחות כלי הדם.
- למטרות מבוססות מים, השתמש בנוזל מוחי שדרה מלאכותי (aCSF) (130 מ"מ NaCl; 30 מ"מ KCl; 12 מ"מ KH2PO4; 200 מ"מ NaHCO3; 30 מ"מ הידרוקסיאתילפיפרזין אתאן חומצה סולפונית [HEPES]; ו-100 מ"מ גלוקוז) כמדיום עקב דליפה פוטנציאלית לחלל הגולגולת במהלך הדמיה ( איור 3).
4. הכנת צבע רוז בנגל, מתן ואינדוקציה של שבץ מוחי
- הכינו תמיסה טרייה של 20 מ"ג/מ"ל של רוז בנגל ב-aCSF; לסנן ולעקר לפני המתן. אין לעשות שימוש חוזר או לאחסן את רוז בנגל לאחר ערבובו. הכינו פתרון חדש לכל ניסוי.
- תן זריקת ווריד זנב של 0.1 מ"ל של רוז בנגל תוך סריקת חלון הגולגולת בלייזר 561 ננומטר כדי להבטיח הזרקה נאותה של התמיסה. הערה: רוז בנגל תוצג תוך 5 שניות לאחר ההזרקה בכלי הדם של המוח. יש למלא את כל הכלי ברוז בנגל.
- לאחר הזרקה נאותה של צבע רוז בנגל בחר כלי מתאים לפקקת על סמך קוטר הכלי (40-80 מיקרומטר) כדי להבטיח שחזור של נפח נגע מסוים. הבדיל בין עורקים לוורידים על ידי התבוננות בכיוון זרימת הדם: העורקים יעברו מקוטר גדול יותר לכלי בקוטר קטן יותר, הוורידים יעברו מכלי קוטר קטנים יותר לקוטר גדול יותר. זה מושג בקלות על ידי הדמיה לאחר הזרקת רוז בנגל.
- שנה את הגדרת המיקרוסקופ באופן הבא:
- הגדל את זמן השהייה. הערה: זה ישתנה בהתאם למערכת המיקרוסקופ שבה נעשה שימוש.
- הגדל את עוצמת הלייזר ל -100%.
- אסוף תמונות רצף זמן במהירות של פריים לשנייה באמצעות מהירות הסריקה המרבית.
- סרוק את העכבר עד שנוצר קריש יציב בתוך הכלי. הערה: זה מושג בדרך כלל תוך 5 דקות מסריקה רציפה (ראה איור 4).
- לאחר השראת היווצרות קרישי דם באמצעות רוז בנגל, הסר את העכבר מאזור ההדמיה בחזרה למיקרוסקופ הניתוח. הסר בזהירות את טבעת הנירוסטה מהגולגולת. בדוק את חלון הגולגולת לאיתור דימום. אם מתרחש דימום, הפסק את הניסוי.
- השתמש בתפר מונופילמנט 6.0 כדי לסגור את החתך מעל הגולגולת. יש להניח משחה אנטיביוטית לאורך קו התפר כדי למנוע זיהום. יש להזריק בופרנקס (0.05 מ"ג/ק"ג) תת עורית כל 12 שעות למשך שלושה ימים לטיפול בכאב.
- החזר את העכבר לתא התאוששות לאחר הוצאתו מחומר ההרדמה עד שהוא ער לחלוטין ותנועה חופשית.
- החזר את העכבר לכלוב נקי להמשך חקירה במועד מאוחר יותר.
