הערכת שלמות מחסום הדם-מוח במודל של חולדות פגיעה מוחית הנגרמת על ידי לייזר

תקציר

מקור: Kuts, R. et al. פגיעה מוחית הנגרמת על ידי לייזר בקליפת המוח המוטורית של חולדות. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מדגים את הערכת תקינות מחסום הדם-מוח (BBB) בעקבות פגיעה מוחית הנגרמת על ידי לייזר בחולדות. צבע מעקב מוזרק לווריד הזנב, ומאפשר לו להסתובב למוח ולדלוף לרקמה דרך ה-BBB הפגוע. לאחר מכן המוח מופק ומעובד כדי לשחרר את הצבע. עוצמת הקרינה של הצבע נמדדת כדי לכמת את היקף נזק ה-BBB הנגרם על ידי לייזר.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הליך ניסויי של פגיעה מוחית הנגרמת על ידי לייזר

1. הקצה 20 חולדות לקבוצה המסומנת כקבוצת לייזר ו-20 חולדות לקבוצת ביקורת אחרת (מופעלת בדמה).
2. חשפו את חולדות קבוצת הלייזר להקרנת לייזר ב-50J X 10 נקודות באופן הבא:
   1. הרדמה של חולדה עם תערובת של 2% איזופלורן בחמצן המאפשרת אוורור ספונטני. בדוק אם יש עומק הרדמה מספיק על ידי צביטת הזנב במלקחיים כדי לראות את היעדר רפלקס הנסיגה.
   2. שמור על טמפרטורת הליבה של גוף החולדה על 37 מעלות צלזיוס לאורך כל הליך הניסוי באמצעות כרית חימום מווסתת טמפרטורת פי הטבעת.
   3. הסר שיער מקומי בעזרת מכונת גילוח וחטא עם 70% אלכוהול ו-0.5% כלורהקסידין גלוקונאט. חזור על שלב החיטוי פעמיים נוספות.
      הערה: גודל החתך הניתוחי צריך להיות כ-3 ס"מ. הסר שיער לפחות 2 ס"מ סביב אזור החתך.
   4. הניחו את החולדה על מחזיק ראש סטריאוטקסי במצב נוטה ובצעו חתך של 3 ס"מ כדי לשקף את הקרקפת לרוחב ולחשוף את האזור שבין ברגמה ללמבדה.
   5. שמור על הרדמה דרך חרוט האף.
   6. השתמש בלייזר איטריום אלומיניום גארנט (Nd-YAG) מסומם בניאודימיום (אורך גל שיא 1064 ננומטר) כדי לתת 50J X 10 נקודות, עם משך פולס של שנייה אחת, לאזור החשוף של הגולגולת מעל ההמיספרה הימנית.
   7. ודא שהחלק המייצר לייזר של המכשיר נמצא במרחק של 2 מ"מ מהאזור החשוף כדי לייצר קרן לייזר. 50J X 10 נקודות נבחרו לאחר הערכה מדוקדקת של שילובים שונים של אנרגיה/פני שטח. שילוב זה יעיל ואינו גורם להרס עצם הגולגולת לאחר מתן למשך פחות משנייה.
      הערה: 2 מ"מ הוא המרחק בין מסוף קרן הלייזר (מהכבל האופטי שדרכו היא מועברת) לבין עצם הגולגולת. במקרה של שימוש בעדשת מיקוד, יש לחשב את המרחק בהתחשב בזווית הנטייה של העדשה כדי למקד את הקרן באזור הנזק הרצוי. הקפידו על בטיחות נאותה בעת שימוש במכשיר לייזר כולל הכשרה מתאימה והגנה על העיניים.
   8. הסר את החולדה מהמכשיר וסגור את הקרקפת עם 3-0 תפרי משי כירורגיים.
   9. הפסק את ההרדמה והחזיר את החולדה לכלוב שלה להתאוששות. יש לתת 0.1 מ"ל של 0.25% בופיבקאין באופן מקומי כדי להפחית את הכאב לאחר הניתוח מיד לאחר הניתוח.
      הערה: ההליך כולו אמור להימשך פחות מ-5 דקות אם הוא מבוצע כהלכה.
3. התבונן בחולדה לאיתור סימני מצוקה במהלך ההחלמה לאחר ההרדמה. לפני היציאה מההרדמה, יש לתת 0.01 מ"ג/ק"ג בופרנורפין תוך שרירי לשיכוך כאבים לאחר הניתוח ולהמשיך במינונים חוזרים כל 12 שעות למשך 48 שעות לפחות.
4. הכפיפו חולדות ביקורת לאותם מצבים מבלי לחשוף אותן ללייזר.

2. ציון חומרה נוירולוגית (NSS)

1. הערך את ציון החומרה הנוירולוגית 24 שעות לאחר הפגיעה המוחית הנגרמת על ידי לייזר באמצעות ציון של 43 נקודות. בדוק את בעלי החיים עבור ליקויים נוירולוגיים, הפרעות התנהגות, משימת איזון אלומה ורפלקסים, והקצה ציונים גבוהים יותר עבור מוגבלויות חמורות יותר.

3. הערכת פגיעה מוחית

1. קביעת מידת שבירת מחסום הדם-מוח (BBB)
   } הערה: הערכת שבירת BBB 24 שעות לאחר הפגיעה המוחית הנגרמת על ידי לייזר באופן הבא:
   1. מתן 2% אוונס בלו מעורבב עם תמיסת מלח של 4 מ"ל/ק"ג תוך ורידי לחולדות באמצעות את וריד הזנב הקנולטי ולאפשר לתמיסה להסתובב במשך שעה אחת.
   2. המתת חסד של חולדות על ידי חשיפתן ל-20% חמצן ו-80% CO₂ (באמצעות השראה) 24 שעות לאחר ה-NSS האחרון.
   3. קצרו את הצבע המקומי התוך-וסקולרי באופן הבא:
      1. פתחו את החזה של החולדות בעזרת פינצ'טים כירורגיים ומספריים כירורגיים.
      2. יש להחדיר את החיות במי מלח מקוררים של 0.9% דרך החדר השמאלי באמצעות 110 מ"מ כספית עד לקבלת נוזל זלוף חסר צבע מהפרוזדור הימני.
   4. קוצרים את המוחות ופורסים אותם רוסטרו-זנב לפרוסות של 2 מ"מ.
   5. הפרד את פרוסות המוח השמאלי מהחלקים הימניים כדי להעריך בנפרד את ההמיספרות הפצועות והלא פגועות.
   6. שקלו, הומוגניזציה באמצעות מכתש ועלי, ולאחר מכן דגרו על רקמות המוח ב-50% חומצה טריכלורואצטית למשך 24 שעות.
   7. צנטריפוגה את פרוסות המוח ההומוגניות ב-10,000 × g למשך 20 דקות.
   8. } ערבבו 1 מ"ל של הסופרנטנט מהמוח הצנטריפוגה עם 1.5 מ"ל של 96% אתנול ב-1:3 והעריכו את מחסום הדם-מוח שבירה באמצעות גלאי פלואורסצנטי באורך גל עירור של 620 ננומטר (רוחב פס של 10 ננומטר) ואורך גל פליטה של 680 ננומטר (רוחב פס של 10 ננומטר).
      הערה: שתי קבוצות החולדות עוברות את אותו פרוטוקול לקביעת התפלגות BBB.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
50% trichloroacetic acid	SIGMA - ALDRICH	76-03-9
מטריצות מוח ורקמות	SIGMA - ALDRICH	15013
קנולה ונפלון 22 G	KD-FIX	1.84E+11
צנטריפוגה סיגמא 2-16P	SIGMA - ALDRICH	SIGMA 2-16P
מאזנים אנליטיים קומפקטיים	SIGMA - ALDRICH	HR-AZ/HR-A
משקל שקילה דיגיטלי	SIGMA - ALDRICH	4,000
מספריים לניתוח	SIGMA - ALDRICH	Z265969
Eppendorf pipette	SIGMA - ALDRICH	Z683884
Eppendorf Tube	SIGMA - ALDRICH	EP0030119460
אתנול 96	נוזל
Evans Blue 2%	SIGMA - ALDRICH	314-13-6
גלאי פלואורסצנטי	Tecan, Männedorf Switzerland	דגם Infinite 200 PRO multimode reader
מחמם עם מדחום	Heatingpad-1	דגם: HEATINGPAD-1/2
שרוול עירוי	ABN	IC-500
Isofluran, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017
Multiset	TEVA MEDICAL	998702
Olympus BX 40 מיקרוסקופ	אולימפוס
צלחות פטרי	SIGMA - ALDRICH	P5606
להבי אזמל 11	SIGMA - ALDRICH	S2771
Sharplan 3000 Nd:YAG (נופך אלומיניום איטריום מסומם ניאודימיום) לייזר	תעשיות בע"מ
מחזיק ראש סטריאוטקסי	KOPF	900LS
מזרק סטרילי 2 מ"ל	בראון	4606027V
מחט מזרק 27 גרם	בראון	305620

רופי% דליק ROMICAL