לוקליזציה פלואורסצנטית של חלבוני צומת הדוקים וסיבי עקה בתאי אנדותל

תקציר

מקור: Alluri, H., et al. מחסור בחמצן-גלוקוז וחמצון מחדש כמודל פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה במבחנה לחקר תפקוד לקוי של מחסום דם-מוח. J. Vis. Exp. (2015).

הסרטון מדגים את הלוקליזציה הפלואורסצנטית של חלבוני צומת הדוקים וסיבי מתח בתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח של חולדות (RBMECs). בשכבה החד-שכבתית הלחוצה, נוגדנים המסומנים פלואורסצנטית משמשים לתיוג חלבוני הצומת ההדוק, בעוד שהפלואידין המתויג בפלואורופור מסמן את סיבי הלחץ. המולקולות המסומנות מומחשות לאחר מכן באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

פרוטוקול

1. זריעה של תאי אנדותל

1. השג תרביות ראשוניות של RBMECs מחולדות ספראג דולי בוגרות (או השג אותן באופן מסחרי).
2. טפחו RBMECs בצלחות פטרי מצופות פיברונקטין בגודל 100 ס"מ (50 מיקרוגרם/מ"ל) באמצעות מדיום גידול תאי האנדותל של מוח העכברוש. החלף את המדיום כל יומיים, עד שמגיעים למפגש.
3. בהגעה למפגש של 80-90%, יש לשטוף בעדינות את התאים במי מלח חוצץ פוספט (PBS) של 5 מ"ל על ידי מערבולת. לאחר מכן מנתקים את התאים על ידי חשיפתם ל-1 מ"ל של תמיסת חומצה חמה של 0.25% טריפסין-אתילן-דיאמין-טטראצטית (EDTA), מאוזנת ל-37 מעלות צלזיוס.
4. דגור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 2-5 דקות עד שהתאים מנותקים ומתפזרים.
   הערה: הקש על צלחת התרבית כדי לנתק את התאים. הצג תאים מתחת למיקרוסקופ כדי לאשר ניתוק מוחלט של תאים מפני השטח של הצלחת.
5. הוסף 5 מ"ל מדיה שלמה לצלחת הפטרי כדי לנטרל טריפסין. הוציא את המדיום המכיל תאים מנותקים ואסוף אותו לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
6. צנטריפוגה של המדיה המכילה תאי אנדותל ב-220 x g למשך 5 דקות.
7. שאפו את הסופרנטנט ושמרו על התאים המכילים גלולה. השעו את הגלולה לתוך 3-5 מ"ל מדיום גידול תאי אנדותל טריים של מוח חולדה על ידי ערבוב עדין למעלה ולמטה עם פיפטה. לאחר מכן ייספרו התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי או המוציטומטר.
8. העבירו את תרחיף התאים לפיברונקטין (50 מיקרוגרם/מ"ל) מצופה מראש עם מערכת שקופיות תא סטריליות 8 בארות, 0.7 ס"מ²/באר עם צפיפות זריעה שנעה בין 10,000-15,000 תאים לבאר. גדלו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד להשגת מפגש
   } הערה: לביצוע כתמים מערביים או ניסויים אחרים, ניתן לגדל תאים בכלי תרבית תאים בגודל 10 ס"מ או בכלים מיוחדים לפי דרישת הניסוי.

2. מחסור בחמצן וגלוקוז (OGD-R) {{}} במבחנה {{}}

1. השתמש במערכת תרבית תאי היפוקסיה כדי לחקור את ההשפעות של OGD-R על RBMECs ב (ראה {{}}איור 1{{TAG_ 111}}). הגדר וכיול את מערכת תרבית תאי ההיפוקסיה לפני תחילת הניסוי, בהתאם להוראות היצרן.
2. הסר את מגלשות התא המשולב (שלב 1.8) מהחממה של 37 מעלות צלזיוס. החלף את המדיום השלם בשקופית התא במדיום נשר לא מחומצן, ללא גלוקוז, מדיום הנשר המותאם של דולבקו (DMEM) והוצב בתא היפוקסיה ב-95%, N₂ ו-5% CO₂ למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס, כדי לייצג את מצב OGD.
3. העבר את התאים בחזרה לחממה עם 95% O₂, 5% CO₂ ב-37 מעלות צלזיוס ומסופק עם תאי אנדותל טריים של מוח חולדה מדיום שלם ודגירה למשך שעה נוספת ב-37 מעלות צלזיוס.
   {{TAG_ 154}}הערה: שלב זה מייצג מצב של חמצון מחדש.
4. השתמש בשקופיות התא ללוקליזציה של אימונופלואורסצנציה ותיוג רודמין פלואידין (ראה סעיף 3).

3. אימונופלואורסצנציה לוקליזציה של זונולה אוקלודנס-1 (ZO-1) ואקטין חוטים} ({{}} f-actin) תיוג באמצעות רודמין פלואידין

1. חשיפה התא מחליק המכיל חד-שכבות RBMEC ל-100 מיקרוליטר של opti-MEM / מדיית סרום מופחתת / באר למשך שעה. שטפו את החלקות התא 3 פעמים ב-100 מיקרוליטר של מי מלח חוצץ פוספט (PBS, pH 7.0-7.2).
2. תקן את התאים באמצעות 100 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד ב-PBS (pH 7.0-7.2) למשך 15 דקות ושטוף את מגלשות החדר 3 פעמים נוספות ב-PBS (pH 7.0-7.2).
3. לחדור לתאים באמצעות 100 מיקרוליטר של 0.5% טריטון X-100 ב-PBS, (pH 7.0-7.2) למשך 15 דקות נוספות. יש לחסום עם 100 מיקרוליטר של אלבומין בסרום בקר (BSA) 2% ב-PBS למשך שעה. לאחר שלב זה, צבע/תייג תאים עבור ZO-1 או f-actin.
   1. לצביעה אימונופלואורסצנטית דגרו על התאים עם נוגדן ראשוני נגד ארנב כנגד ZO-1 ב-1:150, שהוכן ב-2% BSA-PBS למשך הלילה (O/N) ב-4 מעלות צלזיוס. שטפו את התאים 3 פעמים ב-PBS (pH 7.0-7.2). דגירה עם 100 מיקרוליטר של נוגדן משני נגד ארנב מתויג Fluorescein isothiocyanate (FITC) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (RT).
   2. לסימון רודמין פלואידין, לאחר החסימה, חשפו את התאים ל-100 מיקרוליטר של רודמין פלואידין בדילול של 1:50, שהוכן ב-2% BSA-PBS, למשך 20 דקות.
   3. שטפו את התאים מצביעה אימונופלואורסצנטית ותיוג רודמין פלואידין ב-PBS, (pH 7.0-7.2). הרכיב את התאים באמצעות אמצעי הרכבה המכיל ריאגנט נגד דהייה עם 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI).
4. דמיין את התאים באמצעות עדשת טבילה במים פי 60 והתאים נסרקים במישור אופטי יחיד תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Proox model 110	Biospherix	Model 110
DMEM, no glucose	Gibco, Life technologies	11966-025
Rhodamine Phalloidin	Life technologies	R415
ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody	Life technologies	617300
Nunc Lab Tek II-CC 8 באר סטרילי, שקופיות זכוכית	Thermo scientific	177402
FITC-tagged anti-rabbit secondary נוגדן	סנטה קרוז	SC-2090
DPBS 1X	Thermo scientific	SH 30028.03	ניתן להשתמש בכל PBS אחר זמין