ביצוע אימונוהיסטוכימיה על רקמת מוח של פרימטים שאינם אנושיים

תקציר

מקור: Eid, L. & Parent, M. הכנת רקמת מוח של פרימטים לא אנושיים להטמעה מוקדמת של אימונוהיסטוכימיה ומיקרוסקופ אלקטרונים. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מדגים את הכנת רקמת מוח פרימטים לא אנושית קבועה באלדהיד באמצעות אימונוהיסטוכימיה מוקדמת למיקרוסקופ אלקטרונים. הוא מתאר את השלבים לתיוג חיסוני של חלבון עצבי ספציפי, ואחריו תגובת פרוקסידאז המייצרת משקע צבעוני, המאפשר הדמיה של חלבון המטרה במיקרוסקופ אלקטרונים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המתאימה לבעלי חיים.

1. אימונוהיסטוכימיה טרום-הטמעה (איור 1C)

1. הכינו תמיסת מלאי של 4 ליטר של תמיסת מלח עם חוצץ Tris (TBS, 50 מ"מ, pH 7.6) כדלקמן.
   1. מדוד 2 ליטר מים מזוקקים בכוס של 4 ליטר, הוסף 24.23 גרם טריהידרוקסימתיל אמינומתאן (THAM; C₄H₁₁NO₃), ולערבב כדי להתמוסס.
   2. התאם את ה-pH ל-7.6 עם כ-148 מ"ל של 1 N HCl. יש להוסיף את החומצה בזהירות כדי להימנע מהגעה ל-pH מתחת ל-7.6. הנפח הכולל צריך להיות 4 L.
      זהירות: HCl הוא קורוזיבי מאוד. ללבוש את ה- PPE המתאים.
2. בחר מקטעים המכילים את אזור העניין לעיבוד עבור אימונוהיסטוכימיה EM.
3. שטפו את החלקים הצפים 3x ב-PBS (0.1 M, pH 7.4) למשך 5 דקות ב-RT כדי לשטוף את תמיסת הנוזל לרדיאטור.
4. הכן תמיסה של 0.5% של NaBH₄ מדולל ב- PBS.
   1. שקלו 0.05 גרם של NaBH₄ ודללו אותו ב-10 מ"ל של PBS. אין לכסות. הכן פתרון זה ממש לפני השימוש.
5. דגרו את החלקים בתמיסת NaBH₄ שהוכנה לאחרונה למשך 30 דקות ב- RT. סלע בעדינות. אין לכסות.
6. שטפו 3 פעמים ב-PBS למשך 10 דקות ב-RT, מתנדנדים במרץ עד שאף אחד מגז התגובה לא נשאר.
7. הכן תמיסת חסימה ל-EM עם 2% סרום רגיל מתאים ו-0.5% ג'לטין דגים קרים מדולל ב-PBS.
   הערה: יש לחשב את הכמות על מנת שיהיה מספיק לשלושת השלבים הבאים. השתמשו בנסיוב העשוי מאותו מין של בעלי חיים המארחים את הנוגדן המשני. הימנעו משימוש בשיטות אחזור אנטיגן או מהוספת כמויות קטנות של טריטון (כדי להגביר את חדירת הנוגדנים), מכיוון ששיטות אלו פוגעות משמעותית באיכות הרקמה.
8. דגרו את החלקים בתמיסת החסימה למשך שעה אחת ב-RT. סלע בעדינות.
9. הכן תמיסת נוגדנים ראשונית מדוללת בתמיסת החסימה.
   הערה: ריכוז הנוגדן הראשוני בדרך כלל זהה לזה של אימונוהיסטוכימיה LM, אך שקול לבצע בדיקות עם ריכוזי נוגדנים שונים לפני כן, מכיוון שחלק מהנוגדנים הראשוניים עשויים שלא לעבוד עם אקרולאין. אם כן, ניתן להשתמש בתערובת של גלוטרלדהיד (0.1 - 2%) ו- 4% PFA לזלוף טרנס-לבבי ולהשיג תוצאות דומות. ייעל גם את זמן הדגירה והטמפרטורה.
10. דגרו את החלקים בתמיסת נוגדנים ראשונית למשך הלילה ב-RT עם נדנוד עדין. השתמש בזמן דגירה וטמפרטורה שנבדקו בעבר.
11. שטפו את החלקים 3x ב-PBS למשך 5 דקות ב-RT עם נדנוד עדין.
12. הכן תמיסה של 1:1,000 של נוגדן משני ביוטיניל מדולל בתמיסת החסימה.
    הערה: יש להעלות את הנוגדן המשני כנגד המין המארח המשמש ליצירת הנוגדן הראשוני.
13. דגרו את החלקים בתמיסת נוגדנים משנית למשך 1.5 שעות ב-RT. סלע בעדינות.
14. הכן תמיסת אבידין-ביוטין-פרוקסידאז (ABC) לפחות 60 דקות לפני סיום הדגירה המשנית של הנוגדנים.
    1. השתמש בפיפטה מכוילת כדי למדוד 8.80 מיקרוליטר/מ"ל של תמיסות A ו-B ולדלל אותן ב-PBS.
    2. נדנד בעדינות במשך 60 דקות לפחות ב-RT כדי לאפשר את הקישור המלא בין מולקולות האבידין והביוטין.
15. לאחר הדגירה בתמיסת הנוגדנים המשנית, יש לשטוף 3 פעמים ב-PBS למשך 10 דקות ב-RT.
16. דגרו את החלקים בתמיסת ABC למשך שעה אחת ב-RT. נדנדו בעדינות.
17. שטפו פעם אחת ב-PBS ופעמיים ב-TBS למשך 10 דקות ב-RT עם נדנוד עדין.
18. הכינו תמיסה טרייה של 0.05% 3,3'-diaminobenzidine (DAB) עם 0.005% H₂O₂ מדולל ב-TBS.
    1. שקלו 12.5 מ"ג של DAB ודללו אותו ב-25 מ"ל של TBS קר. הגן מפני אור.
       זהירות: אבקת ה-DAB נדיפה מאוד ומזיקה בשאיפה. הוא מסרטן וטרטוגני. לפיכך, נשים בהריון או מניקות לא צריכות לתפעל מוצר זה, גם כשהוא מדולל. השתמש במסכת N95 בעת מניפולציה ולבש PPE.
    2. סנן את התמיסה והוסף 4.5 מיקרוליטר של 30% H₂O₂ ממש לפני השימוש.
19. דגרו קטעים בתמיסת ה-DAB למשך 3 עד 7 דקות ב-RT. סלע בעדינות.
    הערה: המשקעים החומים לא צריכים להיות כהים מדי כדי למנוע רמה גבוהה של כתמי רקע. יש לייעל את זמן הדגירה בהתאם.
20. עצור את התגובה על ידי שטיפה מהירה פעמיים ב-TBS קר, ואז פעמיים למשך 10 דקות ב-TBS קר ב-RT, ולאחר מכן פעמיים למשך 10 דקות ב-PB, עם נדנוד קל.
    הערה: השימוש ב-PB (ולא ב-PBS) הוא קריטי על מנת לחסל כל עקבות של NaCl, מכיוון שהוא יגיב עם אוסמיום ויצור גבישים.

תוצאות

איור 1: סכמות של שלבים חיוניים של הפרוטוקול. מוח הקוף (A) נחתך למקטעים טוריים עם רטט קירור (B). לאחר מכן הוא מעובד להטמעה מוקדמת של אימונוהיסטוכימיה ומיקרוסקופ א...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נתרן פוספט נטול מים דו-בסיסי	פישר מדעי	S374-500
מונו-בסיסי מונוהידראט נתרן פוספט	EM מדע	SX0710-1
נתרן כלורי (NaCl)	Fisher scientific	S271-3
Hydroxymethyl aminomethane (THAM)	Fisher scientific	T370-500
HCl	EMD	HX0603-3	1N דילול. המוצר מאכל. יש להשתמש עם עוצמה מתאימה.
NaOH	EMD	SX0590-1	5N דילול. המוצר מאכל. יש להשתמש עם הגנה מתאימה.
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	4% דילול. המוצר נדיף מאוד בצורת האבקה שלו ורעיל מאוד. השתמש בזהירות מתחת למכסה אוורור עם הגנה מתאימה.
Acrolein (90%)<	110221	3% דילול. המוצר רעיל מאוד. השתמש מתחת למכסה אוורור עם הגנה מתאימה.
Autopsy venting table	Mopec	CE400
Electronic perfusion	cole parmer	masterflex L/S 7523-90
Needle (perfusion)	terumo	NN-1838R	18G 1 1/2
Needle	terumo	NN-2713R	21G 1/2
Ketamine			20 mg/kg
Xylazine			4 mg/kg
Acepromazine			0.5 mg/kg
Scalpel
להבי אזמל	רומח נוצה	201011 J9913	מס' 22 לניתוח ומס' 11 ל-EM
מספריים כירורגיים
Rongeurs
Vibratome	Leica	VT 1200S	כיול הלהב לפני כל שימוש, כאשר המכשיר מאפשר זאת
Vibratome razor blade	Gillette	GIN 642107
Glycerol	Fisher scientific	G33-4	30% דילול
Ethylene glycol	Fisher scientific	E178-4	30% דילול
נתרן borohydride	sigma	S-9125
Normal horse serum	Jackson immunoResearch Laboratories	008-000-121	2% דילול
ג'לטין דג קר	Aurion	900.033	דילול של 0.5%. המוצר המקורי מרוכז ב-40%
Primary antibody, SERT	Santa Cruz biotechnology	SC-1458	1/500 דילול
Primary antibody, ChAT	Chemicon (Millipore)	AB144P	1/25 דילול
נוגדן ראשי, TH	ImmunoStar	22941	1/1000 דילול
נוגדן משני ביוטיניל, עז	מעבדות וקטוריות	BA-9500	1/1000 דילול
נוגדן משני ביוטיניל, mouse	Vector laboratories	BA-2000<
Vectastain elite ABC kit	Vector laboratories	PK6100	8.8 μL/mL של A ו-B כל אחד
3'3 diaminobenzidine (DAB)	Sigma	D5637	0,05% דילול. המוצר נדיף מאוד בצורת האבקה שלו ורעיל. אין לזרוק פסולת לכיור.
מי חמצן 30%	Fisher scientific	H-323	0,005% דילול

td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>sigma pumptd style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>1/1000 דילול