מאמר שיטה

צביעה אימונוהיסטוכימית של קריוסקציות רקמת קורונל של חולדות עבור מיקרוגליה ונוירונים

28 באפריל 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Evilsizor, M. N., et. al., פריימר לאימונוהיסטוכימיה על רקמת מוח של חולדה בהקפאה: דוגמה לצביעה עבור מיקרוגליה ונוירונים. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מדגים תהליך צביעה אימונוהיסטוכימי שלב אחר שלב על רקמת מוח של חולדה שהוקפאה כדי להמחיש את הסידור המרחבי של מיקרוגליה ונוירונים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבחינת אתיקה של בעלי חיים.

  1. Tissue Staining
    1. בקופסת צביעה אטומה לאור, צור "תא לחות" עם רקמות נטולות מוך ספוגות במים נטולי יונים.
    2. יבש את קצוות השקופית עם טישו נטול מוך, השתמש בעט פאפ מיני כדי ליצור גבול דוחה נוזלים ממש בקצה השקופית, הרחק מקטעי רקמה. גבול זה אמור להבטיח מרווח רב בין המניסקוס של הנוזל לקצה הרקמה כך שמתח הפנים לא ישפיע על הצביעה.
      הערה: ניתן ליישם את הגבול דוחה עט הפאפ לפני 1.1.3 אם הנוגדנים המעניינים אינם דורשים אחזור אנטיגן במיקרוגל. אם עט הפאפ הוחל לפני הכביסה ב-PBS, יש לבדוק את תקינות הגבול דוחה הנוזלים בשלב זה. השתמש בעט מיני-פאפ כדי למלא את כל הרווחים בגבול.
    3. עם שקופיות מונחות אופקית, חסום קשירת אנטיגן לא ספציפית על ידי דגירה בסרום 4% v/v ב-PBS (תמיסת בלוק). פיפטה 300 מיקרוליטר של תמיסת בלוק לכל שקופית למשך שעה בטמפרטורת החדר. ודא שתמיסת הבלוק משתרעת על עט הפאפ בקצה השקופית ומכסה לחלוטין את הרקמה כדי למנוע כתמים לא אחידים הנגרמים ממתח פנים ליד הרקמה.
      1. השתמש בסרום מאותו המין שבו נוצר הנוגדן המשני. הערה: בהליך זה, הנוגדנים המשניים מיוצרים בחמור, וכך משתמשים בסרום חמור. אם משתמשים בנוגדנים משניים משני מינים שונים או יותר, כלול נסיוב מכל מין.
    4. נוגדן ראשוני של פיפטה על שקופיות. הערה: ריכוזי הנוגדנים לצביעה זו עברו אופטימיזציה של 1:5,000 ו-1:500 עבור Iba1 ו-Pan-neuronal, בהתאמה. ריכוזים אלה נמצאו כמראים צביעה משמעותית ללא כתמי רקע.
      1. יש לדלל את תמיסת החסימה ל-1% סרום ב-PBS ולהוסיף נוגדנים ראשוניים. פיפטה 300 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית בסרום של 1% לכל שקף. שוב, ודא שהנוזל נמצא בקצה עט הפאפ. יש לדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      2. כלול שלוש שקופיות בקרה: אחת שאינה מכילה נוגדנים Iba1 או Pan-עצביים, אחת עם Iba1 ללא נוגדן פאן-עצבי, ואחת עם נוגדן פאן-עצבי ללא Iba1. צבעו את השקופיות הללו באותה ריצה עם אותם תמיסות, אולם השמיט את הנוגדנים הראשוניים כדי לבדוק את הקישור הלא ספציפי של הנוגדנים המשניים.
    5. למחרת בבוקר, שטפו את השקופיות שלוש פעמים ב-PBS למשך 5 דקות כל אחת, והחליפו את התמיסה בין כביסות.
    6. נוגדנים פלואורסצנטיים רגישים לאור, לכן, משלב זה ואילך, צמצמו את החשיפה לאור על ידי הקפדה על מיכלי כביסה עטופים בנייר כסף וקופסאות הכלאה שחורות או מודגרות בחושך. יש לזרוק את הנוגדנים המשניים המתאימים בכל המגלשות ולדגור במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר בריכוז של 1:250 בתמיסת בלוק (ראה שלב 1.2.3) ב"תא לחות" אטום לאור (ראה שלב 1.2.1).
      1. השתמש בנוגדנים משניים באורכי גל שונים. כאן, עבור הנוגדן העיקרי נגד ארנב Iba1, השתמש בחמור נגד ארנב 594 כנוגדן המשני המתאים. עבור הנוגדן העיקרי נגד עכבר פאן-עצבי, השתמש בנוגדן נגד עכבר חמור 488 כנוגדן המשני המתאים. לחלופין, השתמש נגד ארנב 488 ונגד עכבר 594.
    7. שטוף שקופיות שלוש פעמים ב-PBS למשך 5 דקות כל אחת.
    8. אופציונלי: בצע צביעה גרעינית.
      1. מקם בהוכסט (או כתם גרעיני אחר) בריכוז של 0.03 מיקרוגרם/מ"ל במזוקק כפול H2O למשך 60 שניות בדיוק.
      2. שטוף שקופיות שלוש פעמים ב-PBS למשך 5 דקות כל אחת.
    9. שטיפה ב-ddH2O.
  2. Coverslipping
    1. Coverslip slides עם מדיום הרכבה מימי, כגון Fluoromount-G או ProlongGold. הקפידו להסיר את כל הבועות באמצעות אפליקטור עם קצה כותנה.
      הערה: ניתן להשתמש בחומרי הרכבה אחרים, אולם דימום גבוה בין צבעים צוין על ידי חלקם תוך ימים מהחלקת הכיסוי.
    2. השתמש בלק שקוף כדי לאטום את הקצוות, ולמנוע מהחלקים להתייבש עקב אידוי. הניחו ללק להתייבש בכלי אטום לאור בזמן שהשקופיות נשארות שטוחות ובטמפרטורת החדר, ולאחר מכן אחסנו בכלי אטום לאור עטוף בנייר כסף בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם החומר/ציוד
פישרברנד סופרפרוסט פלוס שקופיות זכוכית} פישר סיינטיפיק22-034-979משמש להרכבת רקמות
}Oven}Thermo Scientific51028112
מיני עט פאפ Life Technologies00-8877
Andwin Scientific Tissue-tek Slide Staining Dish}Fisher Scientific}22-149-429} משמש לכל השטיפות במהלך הצביעה, וכן מדרגת הוכסט
Kimwipes} פישר סיינטיפיק06-666-A משמש לייבוש שקופיות
} תיבת צביעה שחורה} טד פלה}21050משמש לחסימה וצביעה של שלבי
סרום חמור נורמליפישר סיינטיפיק}50-413-253משמש לדגירת חסימה ונוגדנים
} עכבר α-פאן-נוירולוגי nalMilliporeMAB2300משמש לנוגדנים ראשוניים
Rabbit α-Iba1}Wako Chemical{{TAG_ 103}}019-19741משמש לנוגדנים ראשוניים
{{}}חמור α-ארנב 594ג'קסון אימונוסקר} 711-585-11 52משמש לנוגדנים משניים
חמור α-עכבר 488ג'קסון אימונוסקר}715-545-150משמש למחקר משני נוגדנים
}Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01} משמש להחלקת כיסויים
}Coverslips}Fisher Scientific}12544E}{{}}} משמש להחלקת כיסוי
}Axio Observer.Z1 ו-LSM 710 (סריקת לייזר, confocal)קרל זייסN/Aמשמש להדמיה
Axioskop A2}קרל זייסN/A} משמש להדמיה
} {{TAG_ 36}}משמש לייבוש רקמות {{TAG_ 79}}
}

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

IBA1Pan Neuronal

מאמרים קשורים