צביעה אימונוהיסטוכימית של סמנים ביולוגיים בקטעי נוירוספירה של גידול מוח

תקציר

מקור: Núñez, F. J., et al.{{}} הערכת סמנים ביולוגיים בגליומה על ידי אימונוהיסטוכימיה על תרביות נוירוספרה תלת-ממדיות של גליומה משובצת פרפין. J. Vis. exp. (2019).

סרטון זה מדגים טכניקה אימונוהיסטוכימית לתיוג סמנים ביולוגיים של גידול בנוירוספירות של גידולי מוח משובצים בפרפין. החלקים הנוירוספריים עוברים הסרת פרפין והחזרת נוזלים, ולאחר מכן טיפול לחשיפת אתרי סמנים ביולוגיים. לאחר מכן מוחלים נוגדנים ראשוניים ומשניים כדי לסמן את הסמנים הביולוגיים הללו. הנוגדנים המשניים קשורים על ידי אנזימי פרוקסידאז מצומדים של אבידין, המחמצנים סובסטרטים כרומוגניים כדי לציין מיקומי סמנים ביולוגיים. לבסוף, הושלמו צביעה גרעינית והכנת שקופיות לניתוח מיקרוסקופי.

פרוטוקול

1. אימונוהיסטוכימיה (IHC) של נוירוספרות משובצות פרפין (NS)

1. ממיסים פרפין על ידי הנחת השקופיות במתלה מתכת ודגירה שלהן ב-60 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
2. דה-פרפין של השקופיות על ידי דגירה ברכבת התייבשות בטמפרטורת החדר (RT): 3x קסילן למשך 5 דקות, 100% 2x אתנול למשך 2 דקות, 95% 2x אתנול למשך 2 דקות, 70% 1x אתנול למשך 2 דקות ו-1x מים נטולי יונים למשך 2 דקות. מכאן, שמור את המגלשות במי ברז עד לאחזור האנטיגן, שכן התייבשות תגרום לקשירת נוגדנים לא ספציפית.
3. דגרו את השקופיות במאגר ציטראט (10 מ"מ חומצת לימון, 0.05% חומר ניקוי לא יוני, pH 6) ב-125 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות וב-90 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות. תנו להם להתקרר, ואז שטפו את השקופיות 5 פעמים במים מזוקקים.
4. דגירה של שקופיות ב-RT ב-0.3% H₂O₂ למשך 30 דקות.
5. }שטפו את השקופיות 3 פעמים במאגר כביסה (0.025% חומר ניקוי במי מלח Tris-buffered [TBS]) למשך 5 דקות עם תסיסה עדינה.
6. דגרו את השקופיות ב-RT עם תמיסת חסימה (10% סרום סוס, 0.1% אלבומין בסרום בקר [BSA] ב-TBS) למשך 30 דקות.
7. דגרו את השקופיות למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס בתא לח עם נוגדן ראשוני שהוכן בתמיסת דילול (0.1% BSA ב-TBS). שטפו את השקופיות 3 פעמים במאגר כביסה למשך 5 דקות עם תסיסה עדינה.
8. דגרו את השקופיות ב-RT למשך שעה אחת עם נוגדן משני ביוטיניל שהוכן בתמיסת דילול. שטפו את השקופיות 3 פעמים במאגר כביסה למשך 5 דקות עם תסיסה עדינה.
9. דגרו את המגלשות ב-RT בחושך למשך 30 דקות עם קומפלקס חזרת ביוטינילית. שטפו את השקופיות 3 פעמים במאגר כביסה למשך 5 דקות עם תסיסה עדינה.
10. דגרו את השקופיות עם מותגי מצע 3,3′-Diaminobenzidine (DAB)-H₂O₂ כאן למשך 2-5 דקות ב-RT.
11. } שטפו 3 פעמים במי ברז. טבלו (1-2 שניות) את השקופיות בתמיסת המטוקסילין כדי להכתים אותן, ולאחר מכן שטפו אותן היטב במי ברז עד שהן צלולות.
12. ייבשו את השקופיות באופן הבא: דגירה במים מזוקקים למשך 2 דקות, טבילה 3 פעמים באתנול 80%, דגירה באתנול 95% פעמיים למשך 2 דקות כל אחת, דגירה ב-100% אתנול פעמיים למשך 2 דקות כל אחת, ולבסוף בקסילן 3 פעמים למשך 3 דקות כל אחת.
13. כסו את השקופיות עם אמצעי הרכבה מבוסס קסילן ותנו להן להתייבש על משטח ישר ב-RT עד שהן מוכנות להדמיה.

הערה: אם מבצעים צביעת DAB, ניתן לאחסן את השקופיות ב-RT. עם זאת, אם מבוצעת צביעה אימונופלואורסצנטית, יש לאחסן שקופיות בחושך בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס כדי להפחית את הלבנת האור.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ארנב פוליקלונלי אנטי-ATRX,	סנטה קרוז ביוטכנולוגיה	sc-15408	IHC, 1:דילול 250
ארנב פוליקלונלי אנטי-קי-67	Abcam	Ab15580	IHC, 1:1000 דילול
}ארנב רב-שבטי אנטי-OLIG2	}Millipore	}AB9610	IHC, 1:500 דילול
עיזים פוליקלונל אנטי-ארנב ביוטין מצומד	Dako	E0432	IHC, 1:דילול 1000
ערכת Vectastain Elite ABC HRP	Vector Laboratories Inc	PK-6100
ערכת כרומוגן DAB בטאזואיד{{TAG_ 61}}	Biocare medical	BDB2004 L/price till 12/18