$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המתאימה לבעלי חיים.
1. בחירת פרמטרים של נוירופלסטיות אולטרה-מבנית לניתוח כמותי
- מיפוי אזור העניין
- בחר אזור עניין (למשל, היפוקמפוס או המוח הקטן) ותאם את האזור באטלס המקטעים על ידי בחירת התמונה מהאטלס המכיל את האזור הזה.
- שרטט את גבולות אזור העניין על תמונת הקטע ומצא/הנח את גבולות האזור הללו על דגימת השרף.
- סמן שריטות את גבולות אזור העניין (למשל, היפוקמפוס או מוח קטן) על דגימת השרף, באמצעות מד מחט עדין (26 גרם, 1 אינץ').
- מחממים את דגימת השרף ל-85 מעלות צלזיוס בתנור כדי לרכך את השרף לחיתוך או לחילופין להשתמש במכשיר חיתוך, להב דק או נייר זכוכית.
- הסר את אזור העניין מדגימת השרף בעזרת סכין גילוח. הרכיבו את הדגימה על מוטות אחיזה של זכוכית אקרילית בקליבר הנדרש (למשל, בקוטר של 8 מ"מ ואורך של 1 ס"מ) עם דבק. חתוך את הדגימה המותקנת לחיתוך חצי ואולטרה-דק.
- הכן חלקים דקים למחצה (0.75 מיקרומטר) ואולטרה-דקים (70 ננומטר) של האזור החתוך באמצעות אולטרה-מיקרוטום: הגדר אותו על 1.5 מ"מ לשנייה לעובי של 0.75 מיקרומטר ועל 0.7 מ"מ לשנייה לעובי 70 ננומטר.
- אוספים את החלקים הדקים למחצה על מנשאי זכוכית ומכתימים את החלקים בכחול טולואידין 1% ב- PBS (למשך 4 דקות).
- שוטפים את החלקים מספר פעמים במים דה-יונים. בחן את החלקים המוכתמים תחת מיקרוסקופ האור באמצעות יעדים 4x (NA של 0.1 ∞/-), 10x (NA של 0.22 ∞/0.17), 40x (NA של 0.65 ∞/0.17) ו-100x (NA של 1.25 ∞/0.17).
- אוספים חלקים דקים במיוחד על רשתות ניקל. הכפף את הרשתות ל-TEM ב-180 קילו וולט ובהגדלה של פי 3,200, פי 6,000 ו/או פי 8,000.
- ניתוח TEM
- בחר את הפרמטרים האולטרה-מבניים המעניינים לניתוח TEM כמותי (למשל, בוטונים עם שלפוחיות ומיטוכונדריה או אקסונים מיאליניים ולא מיאלינים) וצלם תמונות TEM של פרמטרים אלה בהגדלה של פי 3,500, פי 6,000 ו/או פי 8,000.