ניתוח אולטרה-מבני של קטע מוח של עכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור

תקציר

מקור: Lutz, D., et.al. הערכת פרמטרים של נוירופלסטיות אולטרה-מבנית לאחר התמרה ברחם של מוח העכבר וחוט השדרה המתפתחים. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים את ניתוח ההכנה וההעברה של מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) של קטע מוח מגור עכבר. הפרוטוקול מתחיל ברקמה קבועה של אוסמיום טטרוקסיד המוטמעת בשרף, ואחריה זמירה מדויקת לבידוד אזור העניין ואולטרה-מיקרוטומיה לייצור קטעים דקים למחצה ואולטרה-דקים, המוצגים באמצעות מיקרוסקופ אור ו-TEM, בהתאמה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המתאימה לבעלי חיים.

1. בחירת פרמטרים של נוירופלסטיות אולטרה-מבנית לניתוח כמותי

1. מיפוי אזור העניין
   1. בחר אזור עניין (למשל, היפוקמפוס או המוח הקטן) ותאם את האזור באטלס המקטעים על ידי בחירת התמונה מהאטלס המכיל את האזור הזה.
   2. שרטט את גבולות אזור העניין על תמונת הקטע ומצא/הנח את גבולות האזור הללו על דגימת השרף.
   3. סמן שריטות את גבולות אזור העניין (למשל, היפוקמפוס או מוח קטן) על דגימת השרף, באמצעות מד מחט עדין (26 גרם, 1 אינץ').
   4. מחממים את דגימת השרף ל-85 מעלות צלזיוס בתנור כדי לרכך את השרף לחיתוך או לחילופין להשתמש במכשיר חיתוך, להב דק או נייר זכוכית.
   5. הסר את אזור העניין מדגימת השרף בעזרת סכין גילוח. הרכיבו את הדגימה על מוטות אחיזה של זכוכית אקרילית בקליבר הנדרש (למשל, בקוטר של 8 מ"מ ואורך של 1 ס"מ) עם דבק. חתוך את הדגימה המותקנת לחיתוך חצי ואולטרה-דק.
   6. הכן חלקים דקים למחצה (0.75 מיקרומטר) ואולטרה-דקים (70 ננומטר) של האזור החתוך באמצעות אולטרה-מיקרוטום: הגדר אותו על 1.5 מ"מ לשנייה לעובי של 0.75 מיקרומטר ועל 0.7 מ"מ לשנייה לעובי 70 ננומטר.
   7. אוספים את החלקים הדקים למחצה על מנשאי זכוכית ומכתימים את החלקים בכחול טולואידין 1% ב- PBS (למשך 4 דקות).
   8. שוטפים את החלקים מספר פעמים במים דה-יונים. בחן את החלקים המוכתמים תחת מיקרוסקופ האור באמצעות יעדים 4x (NA של 0.1 ∞/-), 10x (NA של 0.22 ∞/0.17), 40x (NA של 0.65 ∞/0.17) ו-100x (NA של 1.25 ∞/0.17).
   9. אוספים חלקים דקים במיוחד על רשתות ניקל. הכפף את הרשתות ל-TEM ב-180 קילו וולט ובהגדלה של פי 3,200, פי 6,000 ו/או פי 8,000.
2. ניתוח TEM
   1. בחר את הפרמטרים האולטרה-מבניים המעניינים לניתוח TEM כמותי (למשל, בוטונים עם שלפוחיות ומיטוכונדריה או אקסונים מיאליניים ולא מיאלינים) וצלם תמונות TEM של פרמטרים אלה בהגדלה של פי 3,500, פי 6,000 ו/או פי 8,000.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Light microscope Basic DM E	Leica	-	4x (0.1 ∞/-), 10x (0.A. 0.-) 22 ∞/0.17), 40x (NA 0.65 ∞/0.17), 100x (NA 1.25 ∞/0.17) מטרות
מלקחיים המוסטטיים נגד יתושים (12.5 ס"מ, מעוקלים)	FST	13010-12
רשתות ניקל, 200 רשת	טד פלה	1GC200
Razor blades	Schick	87-10489
Technovit 4004 שני רכיבים glue	Kulzer
מכשיר סכין גילוח רוטט דק	Krup	-	עם להבים דקים
Toluidine blue	Sigma-Aldrich	89640
מיקרוסקופ אלקטרונים שידור C20	Phillips	-	up to 200 kV
Ultracut E	Reichert-Jung	-	ultramicrotome
Araldite	CIBA-GEIGY	23857.9	resin להטמעת רקמות
Osmium (VIII)-oxid	Degussa	73219

של Szabo