הדמיה מיקרוסקופית אלקטרונית של אנדוציטוזיס שלפוחית סינפטית בנוירונים בהיפוקמפוס של עכבר

תקציר

מקור: Villarreal, S., et. al., מדידת אנדוציטוזיס שלפוחית סינפטית בנוירונים בהיפוקמפוס מתורבתים. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים את הניתוח של אנדוציטוזיס שלפוחית סינפטית בתאי עצב בהיפוקמפוס מתורבתים באמצעות תיוג פרוקסידאז חזרת ומיקרוסקופ אלקטרונים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המתאימה לבעלי חיים.

מיקרוסקופ אלקטרונים

1. הכן תמיסת גירוי K⁺ גבוהה עם HRP (חזרת פרוקסידאז) כ-31.5 מ"מ NaCl, 2 מ"מ CaCl₂, 90 מ"מ KCl, 25 מ"מ HEPES (pH 7.4), 30 מ"מ גלוקוז, 2 מ"מ MgCl₂, 0.01 מ"מ CNQX, 0.05 מ"מ AP5 ו-5 מ"ג/מ"ל HRP, ולאחר מכן התאם ל-pH 7.4 עם 5 M NaOH.
   1. לעורר את תרבית הנוירונים בהיפוקמפוס עם תמיסת גירוי K⁺ גבוהה של 1.5 מ"ל בטמפרטורת החדר (המכונה K⁺) על ידי תוספת של 1.5 מ"ל לכל באר למשך 90 שניות. במצב מנוחה (המכונה R), יש למרוח את אותו ריכוז של 5 מ"ג/מ"ל HRP למשך 90 שניות, אך עם תמיסת מלח רגילה. עבור דגימת ההתאוששות, יש למרוח תמיסת גירוי K⁺ גבוהה כמו עם דגימת K⁺, ולאחר מכן לשטוף במהירות ולהחליף במי מלח רגילים ולדגור למשך 10 דקות.
2. קיבוע וצביעה
   
   1. הכן 0.1 M Na cacodylate buffer באמצעות 21.4 גרם/ליטר Na cacodylate ב-pH 7.4. תקן תאים עם 4% גלוטראלדהיד במאגר קקודילאט Na 0.1 M למשך שעה לפחות בטמפרטורת החדר. יש לשטוף שלוש פעמים עם מאגר קקודילאט Na 0.1 M למשך 7 דקות כל אחת.
   2. הכן תמיסת Diaminobenzidine (DAB), המורכבת מ-0.5 מ"ג/מ"ל של DAB עם 0.3% H₂O₂ ב-ddH₂O, וסנן עם מסנן 0.22 מיקרומטר. יש למרוח תמיסת DAB של 1.5 מ"ל למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. יש לשטוף שלוש פעמים עם מאגר קקודילאט Na 0.1 M למשך 7 דקות כל אחת.
      זהירות: DAB הוא חומר רעיל וחשוד כמסרטן. אנא השתמש בכפפות ובמעילי מעבדה.
      הערה: תיוג עם DAB מתרחש עקב חמצונו על ידי H₂O₂, כפי שמזורז על ידי HRP. עליות קטנות ברכיבים מביאות לאות מוגבר במדגם. הגדלת ריכוז ה- HRP מזרזת את השפעת הזרז. ריכוזים גדולים מספיק של H₂O₂ מאפשרים תגובות לוואי מתישות עם HRP, ומעכבים את ההשפעה של תיוג³². בעבודה זו, הריכוזים של מערכת תיוג זו נבחרו על סמך המחקר הקיים כיום.
   3. דגרו על הנוירונים עם 1.5 מ"ל של 1% OsO₄ במאגר Na cacodylate 0.1 M למשך שעה אחת ב-4 מעלות צלזיוס כקיבוע לאחר הקיבוע. שטפו שלוש פעמים עם 1.5 מ"ל של 0.1 M Na cacodylate buffer למשך 7 דקות כל אחת.
      זהירות: בשל הרעילות והתגובתיות של OsO₄, שמירת הדגימה על קרח במכסה מנוע כימי עדיפה במקרים רבים על שימוש במקרר לדגירה.
   4. הכן מאגר נתרן אצטט 0.1 M עם 13.61 גרם/ליטר נתרן אצטט ו-11.43 מ"ל/ליטר חומצה אצטית קרחונית ב-pH 5.0. שטפו שלוש פעמים עם 1.5 מ"ל 0.1 מאגר אצטט ב-pH 5.0 למשך 7 דקות כל אחד ודגרו עם 1.5 מ"ל 1% אורניל אצטט במאגר אצטט 0.1 M ב-pH 5.0 למשך שעה ב-4 מעלות צלזיוס. שטפו שלוש פעמים עם 1.5 מ"ל 0.1 מאגר אצטט למשך 7 דקות כל אחד.
      
3. הטמעת אפוקסי
   
   1. ייבשו את תרבית הנוירונים עם שטיפות בודדות של 1.5 מ"ל של 50%, 70% ו-90% אתנול, למשך 7 דקות בכל אחת ולאחר מכן 3 שטיפות של 1.5 מ"ל 100% אתנול למשך 7 דקות כל אחת במכסה אדים.
   2. מערבבים 485 מ"ל/ליטר שרף אפוקסי ביספנול-A-(אפיכלורהידרין), 160 מ"ל/ליטר דודצניל סוקסיניק אנהידריד (DDSA), 340 מ"ל/ליטר מתיל-5-נורבורנן-2,3-דיקרבוקסילי אנהידריד (NMA), ו-15 מ"ל/ליטר 2,4,6-טריס (דימתיל-אמינומתיל)פנול (DMP-30) ליצירת שרף האפוקסי. מערבבים היטב ולאחר מכן מאחסנים תחת ואקום כדי להסיר בועות אוויר.
      הערה: חשוב להסיר בועות אוויר בשרף, במיוחד אלה הקטנות מהנראה לעין בלתי מזוינת, מכיוון שהן עלולות לגרום לחורים בשרף במהלך החיתוך.
   3. הסתנן לדגימה על ידי החלפת האתנול בשרף אפוקסי 50% באתנול למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר, ולאחר מכן 70% שרף אפוקסי באתנול למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר.
   4. החלף את תמיסת שרף האפוקסי בשרף אפוקסי 100% ודגירה למשך 10 דקות ב-50 מעלות צלזיוס. בצע שתי החלפות של שרף אפוקסי טרי 100% עם דגירה למשך שעה ב-50 מעלות צלזיוס. הוסף שרף אפוקסי טרי 100% והניח להתקשות ב-50 מעלות צלזיוס למשך הלילה ולאחר מכן ב-60 מעלות צלזיוס למשך למעלה מ-36 שעות להתקשות.
4. הסר כל דגימה מצלחת הבאר המוטי בעזרת מסור יד של תכשיטן. בחר אזורי עניין, ריכוזים צפופים של תאים, באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך, ולאחר מכן חתוך בלוקים של 70 עד 80 ננומטר לחיתוך לפי מיקרוטום. הרכיבו את אזור החיתוך בצ'אק המיקרוטום וטענו את המיקרוטום. מקם את הצ'אק במיקרוטום והרכיב סכין יהלום כשהקצה מקביל לפני השטח של הבלוק. אסוף קטעים בעובי 70 עד 80 ננומטר ישירות על רשתות בודדות.
5. ממיסים אורניל אצטט במים לתמיסה של 1% לפי משקל, וממיסים בנפרד ציטראט עופרת במים לתמיסה של 3% לפי משקל. כתם את החלקים על ידי טבילה עם 1% אורניל אצטט מימי למשך 15 דקות ולאחר מכן 3% ציטראט עופרת מימי למשך 5 דקות כדי לשפר את הניגודיות של הדגימות.
6. EM imaging
   1. בחן את הקטעים במיקרוסקופ אלקטרונים שידור והקלט תמונות עם מצלמה דיגיטלית CCD בהגדלה ראשונית של 10,000-20,000X.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Neurobasal medium	Thermo Fisher	21103-049	מדיום גדילה לנוירון, התחמם עד 37°C לפני השימוש
B27	Thermo Fisher	17504-044	Gradient עבור התמיינות עצבית
Glutamax	Thermo Fisher	35050-061	שיפוע לתרבות
Trypsin XI from bevine pancrease	Sigma	T1005	Neuronal culture-digest hippocampal tissue
Deoxyribonuclease I מלבלב בקר	Sigma	D5025	תרבית עצבית-מעכבת השעיית
Poly-l-lysine	Sigma	P4832	מיקרוסקופ אלקטרונים, מצע לצמיחה עצבית, למרוח על צלחת מרובת בארות למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ואז לשטוף במים מעוקרים 3 פעמים
חזרת פרוקסידאז(HRP)	Sigma	P6782	מיקרוסקופ אלקטרונים, תיוג שלפוחיות סינפטיות אנדוציטוזיות על ידי זירוז DAB בנוכחות מי חמצן, הריכוז הסופי הוא 5 מ"ג/מ"ל במי מלח רגילים, יש לרענן לפני השימוש
נתרן קקודילאט	Electron Microscopy Sciences	12300	מיקרוסקופ אלקטרונים, מאגר לקיבוע ושטיפה, הריכוז הסופי הוא 0.1 N
3,3′-Diaminobenzidine(DAB)	Sigma	D8001	מיקרוסקופ אלקטרונים, תיוג שלפוחיות סינפטיות אנדוציטוזיות, מצע ל-HRP, הריכוז הסופי הוא 0.5 מ"ג/מ"ל ב-DDW ומסונן, יש לרענן לפני השימוש
מימן תמיסת חמצן	Sigma	H1009	מיקרוסקופ אלקטרונים, תיוג שלפוחיות סינפטיות אנדוציטוזיות על ידי השראת תגובת HRP-DAB, הריכוז הסופי הוא 0.3% ב-DDW, יש לרענן לפני השימוש
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16365	מיקרוסקופ אלקטרונים, מקבעים, הריכוז הסופי הוא 4% במאגר Na-cacodylate, יש לרענן לפני השימוש, לנער היטב לפני השימוש
TEM	JEOL	200CX	מיקרוסקופ אלקטרונים, הדמיה של שלפוחיות אנדוציטוזיות ושינויים
CCD digital camera	AMT	XR-100	מיקרוסקופ אלקטרונים, לכידת תמונות
ציטראט עופרת	Leica microsystems	16707235	מיקרוסקופ אלקטרונים, צביעת רשת

עצבית s תאים צמיגיםאולטרה-מבניים