סרטון זה מדגים את הדמיית הביולומינסנציה של דלקת עצבית בעכברים טרנסגניים, ומציג תגובות לוציפראז-לוציפרין באסטרוציטים פעילים. הפרוטוקול מאפשר כימות לא פולשני של הפעלה אסטרוציטית, ומסייע למחקרים על דלקת במערכת העצבים המרכזית ויעילות טיפולית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הדמיה ביולומינסנציה של דלקת עצבית בעכבר טרנסגני
841 צפיות
⸱
28 באפריל 2025
במאמר זה
תקציר
פרוטוקול
כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים וועדת הביקורת הווטרינרית של JoVE.
Animal Model
- intercross עכברי Tg(Gfap-luc+/-) עם עכברי Tg(M83+/-) המיזיגוטיים כדי ליצור עכברי Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) המיזיגוטיים.
- גנוטיפ של הצאצאים עם PCR בזמן אמת לנוכחות הטרנסגן המקודד אלפא-סינוקלאין אנושי ועם PCR סטנדרטי עבור לוציפראז גחלילית.
- לחסן את בעלי החיים בגיל שישה עד שמונה שבועות.
Inoculum Preparation
- הכן אלפא-סינוקלאין אנושי רקומביננטי מונומרי עם מוטציית A53T במאגר תמיסת מלח Tris-buffered (TBS) המכיל 150 מ"מ NaCl ב-20 מ"מ Tris-HCl (pH 7.2).
- הכן אלפא-סינוקלאין סיברילר לחיסונים על ידי ערבוב של 3 מיקרוגרם/מיקרוליטר של אלפא-סינוקלאין אנושי רקומביננטי מונומרי בשייקר אורביטלי ב-800 סל"ד ו-37 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים.
- יש לדלל מכלולי סיבים בתמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS) כדי להגיע לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם/מיקרוליטר עבור חיסונים תוך-צפקיים.
- פרצול את סיבי האלפא-סינוקלאין עם סוניקטור מוט למשך דקה אחת (40 פולסים של 0.5 שניות עם הפסקה של שנייה אחת בין כל פולס ומשרעת מוגדרים ל-50%) על קרח. כדי למנוע זיהום על ידי זריעה צולבת. השתמש בבדיקות סוניקציה נקיות להכנת חיסון שונה.
זריקות תוך-צפקיות
- עבור זריקות תוך-צפקיות, נרקוטי את החיות תוך זמן קצר בתא הרדמה על ידי שאיפה עם איזופלורן/חמצן באמצעות קצב זרימה של 2 ליטר לדקה והוופורייזר מוגדר ל-2%. צבט את הבוהן של החיה וודא שהיא אינה מושכת את הגפה האחורית שלה כדי להבטיח הרדמה מתאימה.
- מלא מזרק היפודרמי חד פעמי של 27 גרם ב-50 מיקרוליטר של סיבי אלפא-סינוקלאין סוניקטיביים או PBS.
- להזריק ישירות לתוך הצפק של העכבר ולהימנע מחדירה למעי הדק או לצקום הממוקם מאחורי דופן הבטן על ידי החזקת החיה במצב גבי כשהראש פונה הרחק מהחוקר וכלפי מטה בערך ב-45°. עקוב אחר בעלי חיים עד שיתאוששו מההרדמה.
bioluminescence Imaging
- Image Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) עכברים כל 2-4 שבועות באמצעות מערכת הדמיה ביולומינסנציה.
- לפני ההדמיה יש להרדים עכברים בתא איזופלורן/חמצן עם קצב זרימה של 2 ליטר לדקה והוופורייזר מוגדר ל-2%. צבט את הבוהן של החיה וודא שהיא אינה מושכת את הגפה האחורית שלה כדי להבטיח הרדמה מתאימה.
- לגלח ולהסיר את ראשי העכברים בקרם אפילטורי. צבעו את האוזניים בשחור עם טוש לא מגרה כדי לחסום ביולומינסנציה לא ספציפית.
- יש לדלל מלח אשלגן D-luciferin, המצע של לוציפראז, ב-PBS לתמיסת מלאי של 30 מ"ג/מ"ל. יש לאחסן את המוצר בכמות של 1 מ"ל בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. יש להגן על ה-D-לוציפרין המומס מפני חשיפה לאור.
- שקלו את החיות לפני ההזרקה. חשב את הנפח המדויק של D-luciferin להזרקה של 150 מ"ג/ק"ג משקל גוף. הזריק תוך צפקית D-לוציפרין והחזיר את החיה לתא ההרדמה.
- הפעל את תוכנת ההדמיה. לאחר שמערכת ההדמיה הגיעה לטמפרטורת ההפעלה שלה, אתחל את המערכת על ידי לחיצה על כפתור 'אתחול' בלוח הבקרה.
- בחר את הכפתורים 'זוהר' ו'תצלום'. הגדר את זמן החשיפה ל-60 שניות, את ה-binning ל-'בינוני', את ה-F/Stop ל-'1' ואת הרווח האלקטרומגנטי ל-'כבוי'.
- ודא שמסנן העירור מוגדר ל-'Block' ומסנן הפליטה ל-'Open', והגדר את גובה הנושא ל-1.50 ס"מ.
- עשר דקות לאחר ההזרקה עם D-luciferin, הנח את בעלי החיים על צלחת החימום בתא ההדמיה וודא שהלוע שלהם ממוקם כהלכה בשקע ההרדמה. סגור את זרימת האיזופלורן/חמצן מתא השאיפה ופתח את הזרימה לתא ההדמיה בקצב זרימה של 0.25 ליטר לדקה ואידוי של 2%. סגור את דלת תא ההדמיה כהלכה.
- לחץ על כפתור 'רכוש' כדי למדוד את הביו-לומינסנציה, שלוקח 60 שניות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 27-gauge syringe | VWR | 613-4900 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | PZN 4831850 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Secureline lab marker | Neolab | 25040 | |
| D-luciferin potassium salt | Acris | LK10000 | 30 mg/mL stock solution |
| Thermomixer | Eppendorf | 5776671 | |
| Sonopuls Mini20 sonicator | Bandelin | 3648 | |
| מערכת הדמיה IVIS Lumina II | PerkinElmer | ||
| Living Image 3.0 Software | PerkinElmer | ||
| Tg(M83+/-) עכברים או B6; C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J עכברים | מעבדת ג'קסון | 4479 |
