תיוג רטרוגרדי של נוירונים מוטוריים של דרוזופילה באמצעות צבעים ליפופיליים פלואורסצנטיים

תקציר

מקור: Inal, M. A. et. al., מעקב לאחור אחר Drosophila נוירונים מוטוריים עובריים באמצעות צבעים פלואורסצנטיים ליפופיליים. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מדגים את שיטת התיוג לאחור של נוירונים מוטוריים Drosophila באמצעות צבעים ליפופיליים. הצבע נכנס לאקסון, נע לאחור ומסמן את הנוירונים בירוק, מה שמאפשר הדמיה מפורטת של המורפולוגיה וההקרנות שלהם תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.

פרוטוקול

1. ציוד ואספקה

1. חומרים לאיסוף עוברים והכשרת מבוגרים להטיל ביצים
   1. הכן את מנגנון הסינון על ידי ניתוק צינור של 50 מ"ל וחיתוך חור במכסה כדי להגדיר מסנן רשת עם נקבוביות של 100 מיקרומטר (טבלת חומרים) בין הצינור למכסה.
      הערה: לחלופין, ניתן להשתמש במסננות תאים עם נקבוביות של 100 מיקרומטר (טבלת חומרים) לשלב הסינון של איסוף העוברים.
   2. הכינו צלחות אגר עם תערובת אגר ענבים (טבלת חומרים) לפי ההוראות המפורטות. בקצרה, מערבבים בעדינות חבילה אחת של תערובת האבקה לתוך 500 מ"ל מים מזוקקים בטמפרטורת החדר (RT, 23מעלות צלזיוס) ומחממים במיקרוגל את התערובת המומסת לרתיחה נמרצת. לאחר צינון ל-70-75 מעלות צלזיוס, יוצקים את התערובת לצלחות פטרי (60 מ"מ). לאחר התמצקות האגר, אחסן את הצלחות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   3. מכינים משחת שמרים על ידי ערבוב שמרים יבשים פעילים (טבלת החומרים) ומים לעקביות עיסה, ושומרים על 4 מעלות צלזיוס.
   4. השתמש בכלובי איסוף ביצים (עבור צלחת פטרי 60 מ"מ, טבלת חומרים) המספקים זרימת אוויר מספקת.
      
2. הכנת מחטי חיתוך ומיקרו-פיפטות הזרקת צבע
   1. הכן מיקרו-פיפטה להזרקת צבע ומחט חיתוך מאותו צינור נימי בקוטר פנימי של 0.6 מ"מ וקוטר חיצוני של 1.2 מ"מ (טבלת חומרים). משוך את הצינור הנימי על ידי מושך מיקרופיפטה ב-7% מהתפוקה המקסימלית של 170 וולט (טבלת חומרים) ליצירת מחט חדה עם מתחדד באורך ~0.4 ס"מ.
   2. להזרקת צבע, כוונן את המיקרופיפטה עם מיקרופיפטה משופעת (טבלת חומרים) בטכניקת שיפוע בועות המתוארת במדריך המכשיר.
      1. בקיצור, יש להשרות את המטחנה בחומר הרטבה (טבלת חומרים) כדי למנוע מהמים 'לגרור' את קצה המחט. הנח את המחט על המיקרופיפטה clamp ב-25-30° והורד את הקצה לשני שליש מהרדיוס החוצה ממרכז המשטח המשופע. טוחנים את המחט בזמן שמזרק עם צינור דוחף אוויר לתוך המחט כדי להבטיח שהמיקרופיפטה תהיה נקייה משבבי זכוכית.
      2. סמן את המיקרופיפטה בטוש קבוע עם קצה דק כדי לציין את מיקום הפתח בקצה לאחר שיפוע מכיוון שזה מאתגר לאתר את הפתח הצר של המיקרופיפטה שנוצר בזווית.

2. הכנה לאיסוף

1. עובריםודא שהזבובים הבוגרים (20-40 זבובים לבנים מסוג פרא), זכרים ונקבות, נשמרים בתנאים צעירים (<7 ימים) ובריאים לאיסוף הביצים האידיאלי.
   הערה: כדי לעורר הטלת ביצים, זבובים מאומנים בכלוב איסוף הביצים שלהם כמה ימים לפני איסוף הביצים על צלחות אגר מפוספסות ברסק שמרים לפחות פעם ביום.

3. Embryo Staging

1. אפשר לזבובים להטיל ביצים למשך הלילה (או לפחות 15 שעות) ב-RT כדי לאסוף את העוברים ב-15 שעות לאחר הטלת הביצים (AEL), כלומר בשלב 16, כדי לראות את הדנדריטוגנזה של תא הפינה הקדמי (aCC) והנוירונים המוטוריים של הסרטן הגולמי 3 (RP3). בבוקר אוספים את הצלחת עם הביצים.
   הערה: לעוברים ב-15 שעות AEL יהיה מעי מובהק בן 4 חדרים. להדמיה שלבים שונים עקוב אחר הקריטריונים המורפולוגיים הספציפיים שלהם ותנאי ההזדקנות.
2. כדי לאסוף את העוברים, יש לפרק את הביצים המוטלות על הצלחת עם 50% אקונומיקה למשך 5 דקות.
3. לאחר שהכוריון התבהר, שפכו את תכולת הצלחת דרך מנגנון הסינון או מסננת התאים כדי לבודד את העוברים. בעזרת בקבוק מים סחוט, מדללים את האקונומיקה שנותרה על הצלחת ואוספים כמה שיותר עוברים על ידי סילוק התערובת לתוך המסנן.
4. שטפו את העוברים על המסנן פי 3-4 עם עוד מים או עד שריח האקונומיקה יתפוגג. הסר את המסנן מהמנגנון ושטוף את העוברים על צלחת נקייה נוספת עם מים. שפכו את המים מהצלחת החדשה שעליה נמצאים העוברים.
5. הכן שקופית זכוכית על ידי כיסויה בשתי שכבות של סרט ויניל במרכז, ויוצר מלבן. חותכים בריכה מלבנית מהקלטת בעזרת סכין גילוח. הניחו רצועה דקה של סרט דו צדדי לכיוון הקצה העליון של הבריכה, זה המקום שבו יונחו העוברים כפי שמוצג באיור 1.
6. בעזרת מלקחיים עדינים, בחר בנפרד 5-10 עוברים ב-15 שעות AEL והנח אותם על הסרט הדו-צדדי כשהצד הגבי פונה כלפי מעלה. הוסיפו את מי המלח של החרקים רינגר למאגר הדיסקציה כדי להגן על העוברים מפני התייבשות (איור 1).

4. Dissection and Staining

1. בעזרת מחט זכוכית מתחת למיקרוסקופ מנתח (טבלת חומרים), חתכו את קו האמצע של עובר בודד על פני השטח שלו מהחלק האחורי לקצה הקדמי. לאחר מכן גררו את העובר החוצה מקרום הוויטלין מהסרט אל הזכוכית (בקופסה באיור 1). הקפד לא לפגוע ברקמות הפנימיות של העובר.
2. הפוך את רקמות האפיתל מהמרכז והצמד את קצה האפידרמיס על פני מגלשת הזכוכית (איור 1, שיבוץ).
3. באמצעות מחט המחוברת לצינור עם פתח קצה של ~300 מיקרומטר (מוכן על ידי שבירת הקצה הדק של מחט דיסקציה), שאפו או נשפו אוויר כדי לנתק ולהסיר את גזעי קנה הנשימה האורכיים הגביים כמו גם את כל המעיים שנותרו.
4. השתמש ב-4% paraformaldehyde (PFA) בתמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS) כדי לקבע את העוברים למשך 5 דקות ב-RT. שטפו את העוברים 3x עם PBS.
5. צבעו את העוברים ב-1 מיקרוליטר של נוגדן פרוקסידאז נגד חזרת מצומד עם צבע ציאנין 3 (anti-HRP Cy3) (טבלת חומרים) ב-200 מיקרוליטר של PBS למשך שעה. שטפו את העוברים עם PBS 3x לאחר הצביעה.
   הערה: ניתן לשנות את הצבע של anti-HRP על סמך הצבעים הליפופיליים לבחירה להזרקה.

5. מילוי ההזרקה מיקרו-פיפטה

1. חום צבעים ליפופיליים (5 מ"ג/מ"ל של 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine, perchlorate (DiO) או 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′-tetramethylindodicarbocyanine, מלח 4-chlorobenzenesulfonate (DiD), טבלת חומרים) ל-60 מעלות צלזיוס בתערובת של 1:10 של אתנול: שמן צמחי לפני השימוש.
2. הכן שקופית צבע מומס בשמן עבור המיקרו-פיפטה להזרקה. הנח את המיקרופיפטה לתוך מחזיק הנימים (איור 2, #1). בעזרת המיקרומניפולטור (טבלת החומרים), כוונן את המיקרופיפטה כך שתהיה מעל שקופית הצבע. לאחר מכן, התאימו את ה-stage כדי למקם את המיקרו-פיפטה על הצבע (איור 2, #2).
3. כדי למלא את המיקרו-פיפטה, השתמשו במיקרו-מזרק (טבלת חומרים) (איור 2, #3). אספו את הצבע במיקרופיפטה על ידי הגדרת ה-P_i (לחץ ההזרקה) בין 200-500 hPa (הקטופסקאל), ה-T_i (זמן ההזרקה) בין 0.1-0.5 שניות ו-P_c (לחץ פיצוי) ל-0 hPa למשך 5 דקות (איור 2, #4).
4. לאחר איסוף הצבע, הסר את שקופית הצבע והנח את הדגימה על שלב המיקרוסקופ. לאחר מכן, הגדל את ה-Pc לטווח של 20-60 hPa לפני הורדת המיקרו-פיפטה לתוך הדגימה כדי למנוע זיהום של PBS על ידי פעולה נימית.

6. הזרקת צבע לנוירונים

1. אתר את העובר במרכז באמצעות המיקרוסקופ עם עדשת אובייקטיבית פי 10 (טבלת החומרים) ויישר את המיקרופיפטה עם העובר.
   הערה: ניתן לכוונן את גודל טיפת הצבע על ידי שינוי ה-Pi או גודל הפתח של קצה המיקרופיפטה. הטיפה צריכה להיות 10-20 מיקרומטר, שזה בערך רוחב של שריר אחד.
2. שנה את עדשת האובייקט לעדשת 40x טבילה במים (טבלת חומרים) והטביע את העדשה ב-PBS כדי לראות את העובר.
   1. השתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לבדוק את המורפולוגיה העצבית המסומנת על ידי anti-HRP Cy3 ולקבוע את אתר ההזרקה.
   2. במהלך ההזרקה, השתמש במיקרוסקופ brightfield כדי לראות את טיפת הצבע. כאשר העובר נמצא בפוקוס, שנה את מיקום המיקרופיפטה כדי ליצור מגע עדין עם קצה האקסון המעניין (למשל, aCC, RP3).
   3. זרוק את הצבע במקטע חצי בטן ימין (A2-A6) בצומת העצבי-שרירי של aCC או RP3 (איור 3) עם DiD או DiO, על ידי שימוש בתאי העצב המסומנים על-ידי anti-HRP Cy3. שימוש בשליטה הידנית (עכבר; איור 2, 5) שחררו את הצבע והסירו את המיקרופיפטה לאחר הטלת הצבע עם המיקרומניפולטור ועברו לאתר ההזרקה הבא.
      הערה: בניגוד לצבעים אחרים (למשל, צהוב לוציפר, קלצאין) המתפשטים לתאים שכנים דרך צמתים מרווחים, צבעים ליפופיליים מתקשרים לקרומי התאים ואינם עוברים לשכנים. אולם בשל הגודל הגדול יחסית של טיפת הצבע, השיטה הזו גם מביאה לתיוג של השרירים השותפים (איור 3A).
3. דגירה של הדגימה ב-RT למשך שעה אחת לאחר ירידת הצבע לפני ההדמיה.
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן לפני ההרכבה, וניתן לשמור את הדגימה ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. ניתן לספק צבעים ליפופיליים גם באמצעות יונטופורזה אם מגבר תוך תאי בצימוד ישיר (DC) זמין.

7. הדמיה עם מיקרוסקופ

1. קונפוקליהסר את הסרט הדו-צדדי וסרט הוויניל ממגלשת הזכוכית בעזרת מלקחיים.
2. הכן תלוש כיסוי (22 x 22 מ"מ זכוכית כיסוי מס' 1) עם כמות קטנה של שומן ואקום (טבלת חומרים) בארבע הפינות והניח בזהירות על הדגימה, הימנע מבועות אוויר. הסר את כל ה-PBS העודף באמצעות מגבי משימות.
3. דחוף כלפי מטה את החלקת הכיסוי כדי להתאים את מרחק העבודה בין עדשת האובייקט לדגימה. אטום לחלוטין את שולי הכיסויהחלקה עם לק.
4. תמונה בהגדלה של פי 10 ו-100x באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.

תוצאות

איור 1: הגדרת מאגר הדיסקציה. החדר הכחול שנראה על מגלשת הזכוכית נוצר עם סרט ויניל השומר על המאגרים בפנים. הסרט הדו-צדדי מחזיק את העוברים המיושרים כהלכה. בפינה השמאלית התחתונה מוצגת גם דוגמה לעובר מנותח במי מלח. הקצה הקדמי נמצא ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
10x objective lens	Nikon		Plan
40x water-absorbsion lens	Nikon		NIR Apo
צינורות נימיים	Frederick Haer&Co	27-31-1
מיקרוסקופ קונפוקלי<	N/A	Dragonfly Spinning disk confocal unit
Cover glass	Corning		22x22 mm Square #1
DiD	ThermoFisher	V22886
DiI	ThermoFisher	V22888
DiO	ThermoFisher	V22887
Dissecting microscope	Nikon	N/A	SMZ-U
סרט דו צדדי<	665
Dow corning שומן ואקום גבוה	Fisher Sci.	14-635-5D
Dumont #5 Ocps	Fine Science Tools	11252-20
כלוב איסוף ביצים	FlyStuff	59-100
FemtoJet 5247	Eppendorf	discontinued	FemtoJet 4i (חתול מס' 5252000021)
Micromanipulator	Sutter	MP-225
Micropipette beveler	Sutter	BV-10-B
חולץ מחט	Narishige	PC-100
Nutri-fly ענבים אבקת אגר מנות מוקדמות	FlyStuff	47-102
מסנן רשת ניילון	Millipore
תמיסת פרפורמלדהיד 16%, EM grade	מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים	15710	כל דרגות
PBS	Roche	11666789001	נמכר ב-sigmaaldrich, פתרון 10x בקופסה
Photo-Flo 200	Kodak	146 4510	Wetting agent
מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף	Nikon	N/A	Eclipse Ci עם מקור
סרט חשמל ויניל	Scotch	6143
VWR מסנני תאים	VWR	10199-659
Yeast	FlyStuff	62-103	שמרים יבשים פעילים (RED STAR)

td style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Andortd style='צבע רקע:#ffffff;ריפוד:0px 3px;יישור אנכי:תחתון;'>סקוטש EM אור LED