מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית של תאים עצביים מובחנים מתאים שמקורם בדם היקפי

תקציר

מקור: Becker-Kojić, Z. A., et. al., ייצור ללא GM של תאי עצב שמקורם בדם. J. Vis. Exp. (2021)

הסרטון מדגים פרוטוקול להכנת תאים עצביים שמקורם בתאי דם היקפיים מתוכנתים מחדש למיקרוסקופיה פלואורסצנטית, המציג סוגי תאים שונים ושלבי התפתחות באמצעות הדמיה אימונופלואורסצנטית.

פרוטוקול

1. ניתוח מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית של תאים עצביים שמקורם בדם
   1. תרבית התאים במשך 16 יום והסרת המדיה.
      1. דגירה עם קיבוע מחומם מראש המורכב מ -75 מ"ל מים סטריליים, 4 גרם פרפורמלדהיד. יש להוסיף 10 N NaOH לפי הצורך ולערבב עד שהתמיסה מתבהרת. לאחר מכן הוסף 10 מ"ל של 10x PBS, 0.5 מ"ל של MgCl₂, 2 מ"ל של 0.5 מ' EGTA ו-4 גרם סוכרוז. יש לטטר ל-pH 7.4 עם 6 N HCl, ולהביא ל-100 מ"ל מים סטריליים למשך 15 דקות.
      2. יש להשליך את הקיבוע ולשטוף את התאים 3 פעמים למשך 5 דקות בכל פעם. הוסף מיד תמיסת טריטון X של 0.3% טריטון וחלחל לתאים למשך 5 דקות. יש לשטוף 3 פעמים עם PBS ולהוסיף תמיסת חסימה מתוצרת PBS ו-5% BSA.
      3. חסום את התאים בטמפרטורת החדר על צלחת נדנדה למשך שעה.
      4. הכן דילולים מתאימים של נוגדנים ב-1% BSA/PBS ודגר את התאים עם דילול נוגדנים על צלחת נדנדה למשך 1.5 שעות בטמפרטורת החדר. שטפו את התאים 3 פעמים עם PBS למשך 5 דקות כל אחד, דגרו את התאים עם DAPI והרכיבו את הכיסויים עם אמצעי הרכבה להדמיה במיקרוסקופ.
         הערה: נוגדנים עם תווית ישירה ששימשו בניסוי זה רשומים בטבלת החומרים.

חומרים