ניתוח מבני עמילואיד במקטע רקמה באמצעות מיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטי לכל החיים

תקציר

מקור: Nyström, S., et al., הדמיית רקמות עמילואיד מוכתמות באוליגותיופנים מצומדים זוהרים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית היפרספקטרלית והדמיה פלואורסצנטית לכל החיים. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מדגים ניתוח מבני עמילואיד עם מיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטי או FLIM, תוך שימוש בצבע hFTAA כדי לחשוף ליבות קומפקטיות ככחול/ירוק והיקפי לא יציב כמו אדום/צהוב בתמונות מקודדות צבע, המשקפות את ארגון העמילואיד.

פרוטוקול

1. הכנת דגימות רקמה

הערה: ניתן לדמות סוגי רקמות רבים באמצעות חומצה אצטית הפטאמר-פורמיל תיופן (hFTAA) כסמן עמילואיד. hFTAA רגיש לקונפורמציה מצטברת. לכן רצוי לבצע את הצביעה על אגרגטים ללא הפרעה ללא חשיפה לאפיטופים. איכות ספקטרלית אופטימלית מושגת אם קיבוע הרקמות נשמר למינימום. לפיכך, עדיף חומר קפוא טרי, קבוע בעדינות באתנול בזמן הצביעה. עם זאת, ניתן לזהות משקעי עמילואיד גם ברקמה שתוקנה עם למשל , פורמלין. hFTAA בדרך כלל חודר היטב לרקמה. בחר עובי דגימה התואם לטכניקת ההדמיה המיועדת.

1. אם משתמשים בקטעים קבועים בפורמלין, משובצים בפרפין, יש לעבור דה-פרפין בקסילן בן לילה. לאחר מכן, טבלו את החלקים באמבטיות עוקבות של 99% אתנול, 70% אתנול, dH₂O, ותמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS), 10 דקות בכל אחד. הניחו לחלקי הרקמה להתייבש בתנאי הסביבה.
   זהירות: קסילן מטופל תמיד במכסה אדים כימי. קסילן וממיסים אורגניים אחרים מזיקים.
   1. הפשירו קריוקטורים בטמפרטורת החדר. קבעו את חלקי הרקמה ב-10% פורמלין למשך הלילה והחזירו לחות על ידי טבילתם באמבטיות רצופות של 99% אתנול, 70% אתנול, dH₂O ו-PBS, 10 דקות בכל אחד. הניחו לחלקי הרקמה להתייבש בתנאי הסביבה.
2. הוסף טיפות של תמיסת העבודה hFTAA (כ-200 מיקרוליטר) לחלקי הרקמה כדי לכסות אותה. הטיפה צריכה להישאר במקומה על ידי מתח פנים. דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לצביעה.
3. שטפו את תמיסת הצביעה עם 500 מיקרוליטר PBS בעזרת פיפטה ולאחר מכן טבלו את השקופית באמבט PBS למשך 10 דקות. הניחו לחלק להתייבש בתנאי הסביבה.
4. הרכבה באמצעות מדיום ההרכבה הקרינה. אפשר למדיום ההרכבה להתיישב למשך הלילה.

2. FLIM
} הערה: המיקרוסקופ הקונפוקלי מצויד ביחידת מיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטי לכל החיים (FLIM).

1. הגדר את הפרמטרים הבאים עבור המיקרוסקופ הקונפוקלי: חור סיכה, 20; אורך גל עירור, 490 ננומטר; עוצמת לייזר, 0.5% (מתאים להספק ממוצע של 7.5 מיקרווואט). השתמש בלייזרים פולסים ב-40 מגה-הרץ.

2. בתוכנת FLIM, הגדר פוטונים הסופרים מעל 550 ננומטר. בחלון פרמטרי תצוגה, עקוב אחר ספירת הפוטונים עד שספירת המקסימום תהיה בסביבות 4,000 ספירות פוטונים.

3. שמור את הקובץ וייצא אותו כתמונת ספירת פוטונים בודדים (SPC).

4. התאם את הנתונים לדעיכה אקספוננציאלית של 2 רכיבים בתוכנת FLIM. התאמה שנותנת χ² < 2 היא טובה. הערך על ציר ה- y הוא מספר הספירות עבור אורך החיים הנתון.

5. בחר סף לספירות שיכללו, למשל , 100. קוד צבע לפי T1 ובחר טווח חיים. הדעיכה תלויה במבנה העמילואיד שבו ה-hFTAA קשור. נצפו תקופות חיים פלואורסצנטיות בין 300 ל-1,000 ps. שמור את הקובץ.

6. ייצא את הנתונים הגולמיים באמצעות אפשרויות הייצוא ושמור את הנתונים הרצויים בתיקיה חדשה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
hFTAA/Amytracker545	Ebba Biotech
מדיום הרכבה פלואורסצנטי של דאקו	טכנולוגיות זריזות	GM304	,
LeicaDM6000	Leica	,	,
לומן 200	קודם
מערכת ספקטרוויו	מפרט ASI הדמיה טרלית
}תוכנת ספקטרוויו	הדמיה ספקטרלית של ASI		& #160;
LSM780	Zeiss
} Zen 2010b v6.0 תוכנה	Zeiss
מערכת FLIM	} בקר והיקל
Ar/ML 458/488/514	Zeiss
לייזר מתכוונן בכוונון	Zeiss	}

}}{{TAG_ 38}}{{TAG_ 99}}