$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
הקלטת תמונה 1.Live
- }הכנת תאים להדמיה חיה
1. תרבית WT ו-CCR5-/- תאי נוירונים היפותלמוסיים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק המסומן בטרנספורטר גלוקוז 4 (GFP-GLUT4) על כיסוי הזכוכית #1.5 (או בעובי 0.17 מ"מ) שצופה מראש בפולי-D-ליזין בצלחת 6 הבארות.
2. הסר בזהירות את הכיסויים עם נוירונים באמצעות מלקחיים והנח אותו על מגלשות הזכוכית בזהירות.
3. הסר עודפי מדיום/נוזל בעזרת מגבונים עדינים. קפלו את המגבונים פעמיים, והניחו אותם בזהירות על גבי הכיסוי. לחץ בעדינות על המגבונים מבלי להזיז את הכיסוי.
זהירות: אל תלחץ את החלקה על מגלשת הזכוכית בכוח. מטרת שלב זה היא להבטיח שהחלקת הכיסוי לא תזוז/תיסחף במהלך רכישת תמונה הנגרמת על ידי כוח ציפה.
4. הנח כיסויים ושקופיות על המיקרוסקופ דה-קונבולוציה tage, כאשר הכיסוי פונה כלפי מטה, ומאובטח כהלכה. שלב זה נועד להבטיח שמיקום השקופית יישאר קבוע כדי שמשתמשים יוכלו לעקוב אחר אותה קבוצה של תאי יעד מאוחר יותר.
5. התבונן בתאי עצב היפותלמוס WT ו-CCR5-/- עם עדשת אובייקטיבית לטבילה בשמן 60x/1.42 NA.
6. טפל בדגימות התאים שנבחרו עם CCL5 (10 ננוגרם/מ"ל) או אינסולין (10 U/mL) למשך דקה אחת. הוסף 1.5 מיקרוליטר של אינסולין מדולל על קצה הכיסוי.
7. דמיין ורשום את דגימות התאים שנבחרו באופן מיידי. תכנת את תוכנת הקלטת הווידאו להקליט במשך 30 דקות.
2.
} הערה: חלק זה של הפרוטוקול דורש שימוש במיקרוסקופ דה-קונבולוציה ותוכנה מיוחדת לניתוח.
1. הפעל את הכוח של מערכת ההדמיה, אפשר לשלב המיקרוסקופ לאתחל כראוי ולאחר מכן הפעל את מקור אור ה-LED.
2. הוסף שמן טבילה (מקדם שבירה 1.520 לדגימות חיות ב-37 מעלות צלזיוס) על עדשת אובייקטיבית 60x 1.42 NA. הנח את שקופית הדגימה על המיקרוסקופ כשהכיסוי פונה לכיוון עדשת המטרה ואבטח את השקופית כראוי.
3. השתמש בתאורת שדה בהיר או פלואורסצנטי כדי לזהות תאי מטרה. התאם את המיקוד עד שניתן יהיה לצפות בבירור בתאי היעד. אל תזיז את עדשת האובייקט מחוץ לאזור הכיסוי כדי למנוע סימני שריטות מיותרים.
4. זהה טרנספורטר גלוקוז מצומד לחלבון פלואורסצנטי ירוק 4 (GFP-GLUT4) על ידי אות GFP. זהה תאי יעד רצויים לרכישת תמונה. ניתן לשנן את מיקום תא היעד שנבחר לעיון עתידי (ראה איור 1).
5. הגדר פרמטרים ניסיוניים מתאימים (כולל מספר פיקסלים, אורך גל עירור, אחוז שידור, זמן חשיפה, עובי מחסנית, מרווח זמן וזמן הדמיה כולל) על כל תא מטרה. עבור ניסוי זה, מספר הפיקסלים של התמונה נקבע ל-512 x 512 (ניתן להגדיר אותו ל-1,024 x 1,024 לרזולוציה גבוהה יותר) עבור אותות GFP. זמן החשיפה נקבע בין 0.025 ל-0.05 שניות לכל 5 דקות. ניתן לשלוט בהתאמות רוחביות קלות x, y ו-z על ידי התוכנה המומלצת (ראו טבלת חומרים).
6. הגדר את פרמטר החשיפה לכ-2,000 עד 3,000 ספירות כדי להשיג עוצמת פיקסלים מקסימלית. כדי למזער את ההלבנה הקרינה, הפחיתו ככל האפשר את אחוז העברת אור העירור תוך שמירה על זמן חשיפה פחות מ-1 שניות. חזור על שלבים אלה עבור כל ערוץ פלואורסצנטי נוסף וכל תחום עניין בודד.
7. הגדר את הגבול העליון והתחתון של מחסנית Z בכל תא יעד. ניתן להשיג זאת על ידי הזזת שלב המיקרוסקופ עד שהחלק העליון והתחתון של תא המטרה נמצאים שניהם מעט מחוץ למיקוד. המשתמשים יכולים להתאים את הרזולוציה של ציר ה-Z על ידי הגדרת מספר התמונות בין הגבול העליון והתחתון (שניתן לעשות זאת על ידי הגדרת המרחק בין כל תמונה).
8. ערימות של תמונות פורקו ונותחו מאוחר יותר בעזרת התוכנה המתאימה - Velocity מבית PerkinElmer במקרה זה.
